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等温扩增荧光法（IAFT）快速检测食品中沙门菌方法的建立
沙门菌属一类革兰氏阴性杆菌，是引起人类食物中毒的常见细菌之一。传统的沙门菌检测方法主要是经过增菌培养，分离琼脂平板培养等步骤后，通过形态学和染色法和各种生化指标，如硫化氢气体、赖氨酸脱羧酶、氧化酶、靛基质尿素和KCN等加以鉴定。
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LAMP技术在食源性致病菌检测中的应用现状
本文从食源性致病菌检测的重要性入手，综述了环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）技术在食源性致病菌检测中的应用现状，分析了其用于食源性致病菌检测中的优势，旨在为食品安全现场检测技术的建立与应用提供依据。
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实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立
目的 建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法.方法 本文以阪崎克罗诺杆菌OmpA基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度.结果 除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性.在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1 cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100 cfu/100 g.结论 本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌OmpA基因.
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蓝谱环介导等温扩增试剂盒（通用型）
环介导等温扩增（LAMP?）方法采用4条引物来识别目的基因上的6个特异区域，利用具有链置换特性的DNA聚合酶，在恒温（60~65?C）条件下进行扩增，15~60m i n内的扩增效率可达109~1010倍，对仪器设备要求低，水浴锅或恒温箱即可，反应结果可通过肉眼直接观察。DNA样本或RNA样本均可直接使用试剂盒进行反应。
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基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6和HPV16
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导等温核酸扩增技术(LAMP)应用于HPV6和HPV16亚型的检测.该技术设计分别对应于HPV6和16的E6和E7基因序列中6个区段的4条特异引物,在等温条件下(63℃)进行核酸扩增反应1h,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色的变化做为结果判定的标准,并经LA-320实时浊度仪和琼脂糖电泳证实.文中利用这种技术对13份已知的单重感染13种HPV不同亚型的临床样本进行了特异性分析,同时对2个含目的片段的克降质粒的系列稀释物进行了灵敏度分析.结果显示LAMP方法特异性高,颜色法判断的灵敏度均为1000个拷贝DNA分子水平.比Real-time PCR低10～20倍,对62份宫颈刮片临床标本的HPV6和HPV16检出率和HPV分型试剂盒一致.因此,基于颜色判定的环介导等温扩增方法有望应用于人乳头瘤病毒HPV6和HPV16感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心和医院推广和应用的潜力.
关键词： 等温扩增 人乳头瘤病毒(HPV) -
基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因
建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导逆转录等温核酸扩增技术(RT-LAMP)应用于人甲型H1N1流感病毒基因检测.该技术使用对应于人甲型H1N1流感病毒HA序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下(65℃)进行核酸扩增反应1.5h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB的颜色变化做为结果判定标准并经琼脂糖凝胶电泳验证.文中利用这种技术对不同来源及亚型的流感病毒进行了特异性分析,对体外转录的人甲型H1N1流感病毒HA基因RNA的系列稀释物进行了灵敏度分析,成功检测美国CDC提供的人甲型H1N1流感病毒标准品,利用RT-LAMP和RT-PCR同时检测了30份人甲型H1N1和26份季节性流感咽拭子标本.结果显示RT-LAMP方法特异性高,灵敏度可达到60个拷贝RNA分子水平,对临床标本的检出率与常规RT-PCR法相当,利用650nm的比色分析通过标准曲线可以实现对样品的定量.因此,基于颜色判定的环介导逆转录等温扩增方法可用于人甲型H1N1流感病毒感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心流感监测网络实验室和哨点医院推广和应用的潜力.
关键词： 等温扩增 人甲型H1N1流感病毒 -
人乳头瘤病毒的环介导等温扩增检测法
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是引起尖锐湿疣甚至癌变的病原体.PCR技术检测病毒DNA序列具有特异、敏感等特点,但对仪器设备及检测人员技术要求较高,不适合于基层医疗单位临床实验室的常规诊断方法.环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术针对靶基因6个区域设计4条特异引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件下完成扩增,扩增效果可用凝胶电泳、比浊、染色等多种方法检测,具有反应时间短、肉眼可判断结果和不需要PCR仪等优点.国内外利用LAMP技术检测HPV的方法研究偶有报道[1-2],但针对HPV-6和HPV-11成功的方法研究未见文献报道.
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两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中的应用
目的 评估两种等温扩增方法在二代测序(Next generation sequencing,NGS)病毒鉴定中的应用,为利用二代测序进行病毒鉴定提供参考.方法 选取了两份病原已知的重症肺炎病人咽拭子,分别采用单引物等温扩增(Single primer isothermal amplification,SPIA)和多重置换等温扩增(Multiple displacement amplification,MDA)的方法进行反转录扩增.扩增产物进行NGS测序和宏基因组学分析.结果 SPIA扩增产物片段较短,扩增效率较低;而MDA扩增的产物片段较长,扩增效率也高.SPIA法在两份样本中均检测到目标病原,且目标病原基因组覆盖度较高.MDA在其中一份样本中未能检测出目标病原.结论 SPIA与MDA扩增方法均可用于NGS病原鉴定.SPIA法扩增效率较低,成本较高,但检测病原的能力高于MDA.
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乙型肝炎病毒DNA等温扩增体系的建立
当前乙型肝炎病毒(HBV)的全球感染形势依然严峻,流行病学评估目前世界上有4亿多慢性感染者[1],高流行区域如我国人群感染率>15%,基因型分布以B、C型为主.HBV的病毒载量与感染状态密切相关,寻求快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对HBV早期诊断、病程监控及流行病学调查的需求.本研究在Notomi T的环介导等温扩增(LAMP)技术基础上[2],建立起HBV DNA等温扩增的定量检测体系.
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简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术
核酸扩增是基因诊断技术中常用的方法之一,目前核酸扩增的方法很多,如聚合酶链反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、自主序列复制(self-sustained sequence replication ,3SR)以及链置换技术(strand displacement amplification, SDA).
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甲型H1N1流感病毒快速诊断核酸试纸条的研制及应用
目的 建立一种快速、灵敏度高、特异性强的核酸试纸条检测甲型H1N1流感病毒.方法 根据2009年公布新型甲型H1N1流感病毒基因组序列设计合理的引物建立环介导恒温扩增体系,并在体系中加入含生物素的标记探针;在恒温下扩增45 min后产物与醋酸纤维棉片结合进行胶体金免疫试纸条显色反应,利用该方法检测76例确诊甲型H1N1流感病毒感染患者的咽部分泌物,同时采用卫生部公布的合格试剂盒进行对比试验.结果 76例确诊患者咽部分泌物经核酸试纸条检测全阳性,经对比试剂盒检测103拷贝/ml的标本进行10倍稀释后采用核酸试纸条检测结果仍能测出.结论核酸试纸条法检测甲型H1N1流感病毒具有快速、灵敏度高、特异性强的特点更适合于临床快速诊断.
关键词： 流感病毒 H1N1亚型 等温扩增 实时荧光定量RT-PCR -
五种出血热病毒重组酶聚合酶等温扩增方法的建立
目的 建立五种出血热相关病毒,即扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和黄热病毒的一步法重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术,为病原体的确定提供现场快速检测方法.方法 通过基因组序列分析,选择每种病毒的特异核酸片段作为检测靶基因,针对靶基因序列设计RPA检测的引物和探针;取系列稀释的模板基因进行RPA检测,确定其灵敏性;取出血热相关病毒核酸为模板进行RPA检测,确定其特异性;验证不同温度反应条件(37~42℃)对检测结果的影响.结果 五种出血热病毒的RPA反应体系均可有效扩增靶基因,灵敏性为1.5×102~1.5×103copies/反应,与其他出血热相关病毒的核酸无交叉反应;RPA实验在37~42℃均可实现靶基因的有效扩增.结论 建立了五种出血热病毒的RPA等温扩增体系,该体系反应快速,温度范围宽,适用于现场快速检测.
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运用多种方法提升儿童感染性疾病的实验诊断能力
感染性疾病仍然是全世界儿童健康的主要危害。病原体的早期确定和准确鉴别对感染性疾病的预防及有效控制有非常重要的意义，尤其对于控制目前抗菌药物的过量使用以及在细菌性感染中不必要的抗病毒药物的使用有着实用意义。因此，需要结合各种技术手段和方法，建立和完善用于临床实验室和床边的各种快速鉴定病原体或检测宿主生物标志物的诊断系统，并深入认识病原体基因型的流行特点及与其致病性的可能关系，提升儿童感染性疾病的诊断能力。
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核酸等温扩增技术研究进展
核酸扩增技术是生物医学领域病原体确认的常用检测技术.近年新发展起来的核酸等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比PCR技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景.在众多等温扩增技术中,环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用,其他一些新发展起来的等温扩增技术,如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术,也在不断发展与完善之中.为了更好地有选择地开发利用这方面技术,现就这些等温扩增技术的原理、特点及其在疾病检测中的应用进行综述.扩增.整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成.
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诺如病毒检测技术研究应用进展
诺如病毒(Norovirus,NV)首次在1972年美国俄亥俄州诺瓦克镇暴发腹泻疫情的患者粪便中发现[1],故初被称为诺瓦克病毒(Norwalkvirus),后不断地在全球各地的腹泻病人粪便中发现此病毒.2002年8月,在第十二届国际病毒会议上,被正式命名为诺如病毒(Norovirus)[2].诺如病毒是常见的非细菌性急性肠胃炎的病原体之一,粪-口途径是主要传播方式,也可以通过污染的水源、食物及由病人的呕吐物和粪便形成的气溶胶等传播.易在医院、疗养院、学校、幼儿园、船舱、宾馆等人多密集、半封闭的环境中引起暴发性流行.诺如病毒感染的特征为突然发病,呕吐、腹痛和水样腹泻,可伴有发烧和头痛等,所有年龄人群对该病毒敏感,一般潜伏期为24 h～48 h,病程为2d～3d,常自愈.在北半球,每年的11月至次年4月是高发季节.
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环介导等温扩增技术在现场工作中的应用进展
核酸扩增技术是病原微生物检测和遗传性疾病诊断的重要武器,其中常规PCR和实时荧光定量PCR已在临床检验中得到广泛的应用,但这些技术操作复杂,对实验室人员、仪器和环境的要求较高,无法在基层和现场工作中灵活使用.环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是日本学者Notomi等[1]于2000年发明的核酸扩增技术,与PCR技术相比,具有操作简单快速、对仪器和样本质量要求低等特点,尤其适用于现场工作使用.本文主要针对LAMP在现场工作中的技术特点和实际应用情况进行综述,并对其新的技术改进进行归纳和展望.
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环介导等温扩增技术的应用和发展
扩增是生命科学领域的常用研究工具,20世纪80年代出现的聚合酶链反应(PCR)得到了广泛的应用,但该方法需要特殊的仪器、模板的热变性及长时间的温度循环.20世纪90年代出现了几种核酸等温扩增方法:核酸等温扩增法、自序列复制法和链置换扩增法等,它们或者需要精密的仪器,或者在产物检测方面相当繁琐,或者特异性不高等[1-2],均限制了其广泛应用.
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杂交链反应在超灵敏检测方面的应用进展
DNA在生命活动中具有重要意义,针对DNA检测技术日益增多,近些年一种无酶等温高效的超灵敏扩增技术,杂交链反应(HCR)逐渐引起广泛的关注.HCR,仅在特定的核苷酸引发物(NI)和两个特殊设计的发夹DNA(H1,H2)同时存在的情况下进行自组装,实现了原位扩增反应.由于NI,H1,H2的可编辑性及可修饰性,使得HCR适用于分子生物学的各个领域,具有广泛的应用前景.该文通过HCR在核酸检测、蛋白检测、细胞检测及生物成像等方面的应用进展来探究其优点和不足.
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MRSA的分子生物学检测方法研究进展
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA)是引起院内感染和社区感染的重要病原菌之一.由于M R-SA感染的治疗选择有限,且传播速度较快,暴发流行的概率较高,现已成为一个全球性的难题,因此,使临床医生在第一时间获得M RSA感染的准确信息,对疾病的及时治疗有着重要意义.目前,关于M RSA的分子生物学检测方法的研究热点主要集中在高效可靠、成本低廉、简单易行3个方面,本文就近年来M RSA的分子生物学检测方法的研究现状及发展趋势作一综述.
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链置换扩增技术的影响因素研究
目的:探索限制酶、聚合酶、缓冲体系和DTT等对链置换扩增(SDA)实验的影响,以期在商品化试剂条件下组建SDA系统.方法以结核菌IS6110序列为扩增对象设计SDA引物,利用商品化的BsoBI和exo-Bst为实验用酶建立SDA实验系统.对比在不同BsoBI、exo-Bst浓度条件下SDA产物的电泳条带亮度来观察限制酶、聚合酶对SDA效率的影响;对比SDA在pH 7.6的磷酸盐缓冲液和以Tris-HCl为缓冲体系的NE Buffer2、ThermoPol Buffer和EcoPol Buffer中的产物电泳条带的方法来观察不同缓冲体系对SDA效率的影响;对比加入DTT和不加DTT时 SDA产物的电泳条带亮度来观察DTT对SDA效率的影响.结果①在0.1～0.4U/μl浓度范围内,SDA的扩增率与BsoBI含量正相关,而0.8 U/μl BsoBI反而使SDA受到抑制.②在0.08～0.32U/μl浓度范围内exo-Bst用量对SDA的扩增能力没有显著影响;③SDA可以在pH 7.6的磷酸盐缓冲液和ThermoPolBuffer中进行,而不能在NE Buffer2 和EcoPol Buffer中进行;④DTT对SDA的扩增率和特异性都没有显著影响.结论以上实验结果表明在商品化试剂条件下可以构建SDA系统,并得到良好的扩增效果.
