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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对阪崎克罗诺杆菌的鉴定及溯源
目的 研究不同样品前处理方法对VITEK(R)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(VITEK(R) MALDI-TOFMS,以下简称VITEK MS)鉴定阪崎克罗诺杆菌的影响及该方法对阪崎克罗诺杆菌的分型溯源能力,研究VITEKMS与MALDI 7090TMMALDI-TOF/TOF MS(以下简称MALDI 7090)所得图谱的异同.方法 选取3种不同样品前处理方法处理18株阪崎克罗诺杆菌野生菌株、2株阪崎克罗诺杆菌标准菌株和2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株,比较VITEK MS鉴定结果与传统鉴定结果的一致性;通过VITEK MS的鉴定结果和图谱的比对,研究不同样品前处理方法对阪崎克罗诺杆菌鉴定的影响;利用VITEK MS质谱图特征峰的聚类分析,对20株阪崎克罗诺杆菌进行溯源研究;同时比较VITEK MS与MALDI 7090所得图谱,研究两者的异同.结果 20株试验菌株的VITEK MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌,与传统的鉴定结果一致,并与2株非阪崎克罗诺杆菌标准菌株能明显地区分;3种不同样品前处理方法得到的鉴定谱图与标准谱图比对获得的鉴定结果可信度之间差异无统计学意义(P＞0.05),但质谱图中质谱峰数量和相对峰强度有明显差异,其中甲酸提取法在2 000～ 15 000 m/z范围内,相对峰强度＞5 mV的质谱峰数量达15个以上.在相似水平为80％的条件下,VITEK MS的聚类分析将甲酸提取法的20株阪崎克罗诺杆菌分为5个群,通过聚类分析及菌株来源能够推测阪崎克罗诺杆菌传播途径.VITEK MS和MALDI 7090得到的谱图,两者特征峰的出峰位置与相对峰强度无明显差异.结论 MALDI-TOF MS技术可以准确鉴定阪崎克罗诺杆菌:甲酸提取法更适用于阪崎克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS鉴定;MALDI-TOF MS技术对阪崎克罗诺杆菌的溯源研究具有重要价值;VITEK MS与MALDI 7090所得谱图无明显差异.
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实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立
目的 建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法.方法 本文以阪崎克罗诺杆菌OmpA基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度.结果 除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性.在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1 cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100 cfu/100 g.结论 本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌OmpA基因.
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5株阪崎克罗诺杆菌体外侵染人肠上皮细胞能力分析
目的 分析5株阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,C sakazakii)是否能够侵染人肠上皮细胞及其侵染能力.方法 将阪崎克罗诺杆菌与Caco-2细胞以100∶1的接种率接种后共培养4h,裂解细胞将进入细胞的菌落释放出来稀释涂布于LB琼脂平板,计数,计算侵染率.结果 从食源性疾病儿童病例中分离出的两种菌株C sakazakii13SJFB217、C sakazakii 14SJFB412对Caco-2细胞的侵染率分别达到0.0 219％和0.0 165％,从婴幼儿奶粉中分离的两株阪崎克罗诺杆菌C sakazakii 14SJ430、C sakazakii 14SJ431侵染率分别为0.0 071％和0.0 083％;来源于人的阪崎克罗诺菌株比来源于食品菌株对肠上皮细胞有更高的侵染能力.结论 石家庄市腹泻儿童粪便中分离到的2株阪崎克罗诺杆菌属于高侵染能力的菌株.
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阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术研究
[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测方法.[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较. [结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环(cycle threshold,CT)值与模板浓度的对数值具有良好的对应关系[(Y)=-3.06×log(X)+36.63,R2=0.999],低检测浓度为100 CFU/mL,经36℃增菌8h低检测限可达1 CFU/mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5％;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义(x2=0.624,P＞0.05). [结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作.
关键词： 阪崎克罗诺杆菌 实时荧光PCR TaqMan-MGB探针 -
婴儿配方奶粉生产加工过程污染调查分析
目的 对婴儿配方奶粉生产加工过程中的原料和环境中分离的阪崎克罗诺杆菌和铜绿假单胞菌开展PFGE分子分型研究,分析污染途径.方法 在一个批次婴儿配方奶粉生产加工过程中的原料和环境中分别检出了阪崎克罗诺杆菌和铜绿假单胞菌.用限制性内切酶XbaⅠ酶切阪崎克罗诺杆菌,用SpeⅠ酶切铜绿假单胞菌后进行PFGE电泳,并用BioNumerics软件进行聚类分析.结果 4株铜绿假单胞菌的基因指纹图谱完全一致,为同一来源菌株;4株阪崎克罗诺杆菌分为2个基因型.结论 原料、环境、设备和车间工人之间都存在交叉污染,原料是污染的主要源头;环境和设备的CIP清洗死角是污染的藏匿地;车间工人很可能是污染扩散的主要媒介.
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配方奶粉加工过程阪崎克罗诺杆菌PFGE分子分型研究
目的 对配方奶粉加工控制过程中分离的阪崎克罗诺杆菌开展PFGE图谱研究.方法 用XbaⅠ酶切割,脉冲场凝胶电泳技术建立PFGE指纹图谱,BioNumerics V 6.6软件进行聚类分析.结果 46株阪崎克罗诺杆菌共形成了29种PFGE基因指纹图谱.除图谱PT29外,其余菌株的同源性＞60％.1件半成品、3件不同批次的产品分离的菌株图谱一致(图谱PTP3).图谱PTP7、PTP8的菌株分别分离自原料奶粉和浓缩乳清蛋白粉.图谱PTP18菌株分离自成品、筛粉、墙壁、设备传送带样品.图谱PTP27菌株分离自成品、混料(半成品)和α-乳白蛋白.结论 PFGE技术对阪崎克罗诺杆菌具有很好的分型效果.阪崎克罗诺杆菌存在局部流行现象,原料带菌、加工环境是婴儿配方粉阪崎克罗诺杆菌污染的主要途径.
关键词： 配方奶粉 加工过程 阪崎克罗诺杆菌 脉冲场凝胶电泳指纹图谱 -
鼠李糖乳杆菌抑制阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的体内外实验
目的 考察鼠李糖乳杆菌(LGG)对阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的抑制作用.方法 以Caco-2细胞为体外模型,采用黏附侵袭实验研究阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附侵袭作用及佳感染时间,并用不同浓度的LGG与Caco-2细胞作用,确定其抑制阪崎克罗诺杆菌的佳浓度.进一步通过竞争、排斥和置换实验检测LGG对阪崎克罗诺杆菌黏附侵袭的抑制作用.通过体内实验,研究LGG对乳鼠脑膜炎的作用效果.结果 阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞具有黏附侵袭性,佳感染时间为3 h.随着加入LGG浓度的增加,阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附和侵袭作用被显著抑制.LGG能通过竞争、排斥作用抑制阪崎克罗诺杆菌对Caco-2细胞的黏附.LGG对阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎具有预防和治疗作用,且预防效果更显著.结论 通过体内外实验,LGG可以抑制阪崎克罗诺杆菌进入肠屏障,从而减少其穿越血脑屏障的量,终达到预防和治疗脑膜炎的效果.
