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2012-2015年北京市顺义区流感监测结果分析
目的 分析顺义区2012-2015年流感病毒核酸的监测结果,掌握流感流行规律.方法 用实时定量PCR法对采集的流感样病例标本进行核酸检测.结果 2012年9月-2013年8月共检测流感样病例标本1040份,核酸检测阳性标本95例,阳性率为9.13％,高峰出现在12月-次年1月,主要以H3N2和新甲型H1N1流感病毒为主;2013年9月-2014年8月共检测流感样病例标本889份,核酸阳性标本138例,阳性率为15.52％,流行高峰出现在1-3月,以H3N2和甲型H1N1流感、乙型流感病毒为主.在2014年9月-2015年8月共检测流感样病例标本798份,核酸阳性标本151例,阳性率为18.92％,流行高峰出现在2014年11月-2015年4月份,以H3N2和乙型流感为主.检测阳性率高的为60岁以上人群,其次是5-14岁组.结论 2012-2015年,顺义区新甲型H1N1亚型、H3N2亚型、乙型流感均有流行,且各年度优势毒株不一.
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志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究
目的 建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑.方法 根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性.结果 用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PER检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系(Y=-3.93×log(X)+37.34,R=0.999),低检测浓度为30 cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均>35或扩增曲线成一平滑直线.与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义(P>0.05,χ2=0.27).对于纯菌和食品样晶整个检测过程仅需2 h和10 h.结论 志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值.
关键词： 志贺菌 实时荧光PCR TaqMan-MGB探针 -
应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究
目的 建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测.方法 根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养.结果 两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10～20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应.检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌.结论 本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限.
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MGB探针标记-实时荧光PCR方法检测细菌int1基因和ISCR1元件方法的建立
目的 建立一种快速、准确检测细菌中ISCR1复合型Ⅰ型整合子的MGB探针二重实时荧光PCR方法.方法 根据ISCR1复合型Ⅰ型整合子中int1基因和ISCR1元件序列设计特异性引物和探针,在多种经常携带有2种多耐药相关基因元件的细菌中检测其特异性;使用含有2种基因元件特异性序列的重组质粒标准品评价建立方法的灵敏度.结果 建立的MGB二重探针实时荧光PCR检测方法特异性好,携带2种基因元件或单独含有ISCR1或者int1的实验菌株均出现相应特异性扩增曲线,对2种基因元件均不含的菌株进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线.对2种基因元件都存在的实验菌株的扩增中,亦不存在由于2套引物/探针相互影响而造成的干扰扩增.根据标准质粒样品构建的标准曲线可确定其对int1基因和ISCR1元件的检测灵敏度分别为5.89×101拷贝/μl和4.13×101拷贝/μl.结论 本研究成功建立了MGB二重探针实时荧光PCR快速检测方法.
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2010年上海市疑似流行性乙型脑炎患者的病原谱研究
目的 了解上海市疑似流行性乙型脑炎(乙脑)患者的病原谱构成.方法 将2010年5 - 10月收集的145例疑似乙脑患者的93份血清、103份脑脊液标本采用实时荧光PCR(real-time PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELIAS)检测常见脑炎病毒核酸和病毒lgM抗体.检测病毒包括乙脑病毒(JEV)、肠道病毒(EV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、麻疹病毒(MV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒(MuV)、西尼罗病毒(WNV).结果 100例检出病毒核酸和/或病毒IgM抗体阳性(68.97％),病毒核酸或病毒IgM抗体检测阳性作为判断病毒感染的指标,其中EV感染49例(33.79％)、HSV感染22例(15.17％)、JEV感染11例(7.59％)、CMV感染5例(3.45％)、MuV感染3例(2.07％),另有10例病例判断为两种或以上病毒混合感染(6.90％),未检出VZV、MV、RSV、WNV.结论 2010年上海市疑似乙脑患者病原以EV、HSV和JEV为主,提示在乙脑流行季节,需加强病毒性脑炎的监测和鉴别诊断,为临床诊治和疾病防控提供科学依据.
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食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究
目的 利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法.方法 根据志贺菌ipaH基因保守序列设计特异性引物和探针.用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件.用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性.用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性.同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证.结果 志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值(Ct) =32.10 ～3.19 xlog(菌量)(R2=0.994).低检测浓度为2.20 CFU/反应.对死菌DNA抑制效率≥99.97％.31株志贺菌Ct值低为15.04,高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均＞35或无Ct值(呈一条直线).重复试验Ct值变异系数＜3.30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5h,而常规分离培养方法则需要3～5d.结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用.
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实时荧光PCR技术在食品检验领域的应用
食源性致病菌、转基因食品等生物污染监测和控制是食品安全风险监测和控制的重要领域之一,核酸作为每一物种独一无二的身份证明,在食源性致病菌、益生菌、动物源性食品、过敏原食品、转基因食品乃至食品真伪鉴定和检测中是理想的检测载体,结合强大的实时荧光PCR核酸检测技术,为食品安全监测、风险评估及食品品质保障提供了有利的技术支撑.本文对目前实时荧光PCR技术在食品领域的应用和进展作一概述.
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双重 TaqMan 实时荧光PCR 同时检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立
以建立沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌双重TaqMan PCR方法为例，阐述TaqMan PCR方法建立的系统步骤和关键要素为目的，采用根据沙门氏菌FimY和单核细胞增生李斯特菌iap基因序列利用ABI primer express 3.0软件设计了物种特异性引物和TaqMan探针，采用标准曲线优化法对双重反应体系中引物和探针、Mg2+、dNTP浓度和Taq酶用量以及热循环条件等关键要素进行了优化，借助单双重PCR比较试验、多重PCR高低丰度模板抑制试验、灵敏度、特异性和重复性试验对建立的方法进行了验证进而得出了这样的结果：我们建立了涵盖设计要素、质控设置、体系优化、评价指标、验证试验共5个关键环节的双重TaqMan 实时荧光PCR方法建立模式。建立的方法灵敏度高，沙门氏菌100CFU/ml，单增750CFU/ml；特异性强，对8种阳性菌株和37种近缘及远缘关系的阴性菌株成功鉴别的方法。本研究可借鉴应用于所有以核酸为检测对象的TaqMan PCR方法的建立模式。
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改良分子信标-实时荧光PCR同时检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌
目的 建立猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的实时荧光PCR快速检测方法,应用于食品和食物中毒病人标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断.方法 根据GenBank公布的猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌的保守序列(CP000857.1),设计引物和改良分子信标探针,优化PCR程序和PCR成分,以11种细菌为对照,建立实时荧光PCR检测方法,并用71株常见血清型的沙门菌评价该方法的灵敏度和特异性,所建立的方法应用于70份食品样品的检测.结果 该改良分子信标一荧光PCR方法的DNA低检出限为10fg/反应体系,菌液低检出限为20 CFU/反应体系;无交叉荧光信号产生.针对目标菌均出现特异荧光信号.对71株沙门菌属的检测,该方法的灵敏度和特异度为100%.70份食品样品用荧光PCR和传统方法检测猪霍乱沙门菌和丙型副伤寒沙门菌,结果均为阴性.该方法从菌株的核酸提取到检测仅需1.5小时,从样品处理到检测仅需1天时间.结论 建立的实时PCR检测方法快速、灵敏度高、特异性强,可用于食品及食物中毒标本的猪霍乱沙门菌检测以及沙门菌属C群的鉴别诊断,保障食品安全.
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NLRP3基因单核苷酸多态性TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立
目的 建立以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(Nucleotide-binding oligomerization domain,Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing,NLRP3)基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法.方法 以20份健康人血液样本为对象,选择NLRP3基因的两个SNP位点(rs3806265和rs35829419),针对每个位点分别设计1对PCR引物和2条TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增,对SNP位点进行分型.用常规PCR和基因测序的方法对TaqMan探针实时荧光PCR分型的结果进行验证.结果 用建立的TaqMan探针实时荧光PCR分型法对20份样本进行检测,其中rs3806265位点发现Tr基因型3份,TC基因型8份,CC基因型9份;rs35829419位点发现CC基因型20份,无AC和AA基因型.分型结果与常规PCR及基因测序分型方法完全一致.结论 基于TaqMan探针技术的实时荧光PCR方法简单、快速,可实现对NLRP3基因位点的分型检测.
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新型冠状病毒双重荧光RT-PCR检测方法
目的 为快速检测新型冠状病毒,防控疫情的输入,建立一种快速的双重实时荧光RT-PCR检测方法.方法 对WHO公布的单重实时荧光RT-PCR检测引物和探针进行重新设计和优化,建立双重荧光RT-PCR反应体系,分别采用羧基荧光素(FAM)和绿色荧光蛋白(VIC)荧光基团标记探针,实现双基因的同时检测.结果 经优化的双重实时荧光RT-PCR方法有较好的灵敏度和特异性,对阳性对照质粒检测灵敏度为31拷贝/μl,检测健康和普通发热人员咽拭子以及流感病毒无交叉反应.结论 建立了双重实时荧光RT-PCR快速检测方法,提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于新型冠状病毒的快速应急检测.
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实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究
目的 建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系,快速鉴定结核分枝杆菌. 方法 设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针,探针标记以JOE为报告基团,BHQ1为猝灭基团.优化反应条件,建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测方法.通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落,检验方法的特异性、重复性和灵敏度.结果 肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线,CT均值31.35,标准差4.31.健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线.对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2.54％以下,检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性.结论 建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法,具有良好的敏感性和特异性.
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两种基因分析法在口岸沙门菌检测中的应用评价
目的 评估以沙门菌属肠毒素基因(Salmonella enterotoxin gene stn)为靶基因建立的环介导恒温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)沙门菌快速检测方法在口岸卫生检验中的作用.方法 收集河南出入境检验检疫局检测的肉、蛋、奶、水产品、饮料等样本共计165份,采用沙门菌属stn基因LAMP技术、实时荧光PCR与沙门菌显色培养基培养法同时检测,比较沙门菌属stn基因LAMP技术与实时荧光PCR的符合率和一致性,并以显色培养基培养结果为标准评价这两种基因分析方法的敏感性和特异性.结果 165份检验样本检测结果,LAMP检测方法与实时荧光PCR检测结果对比,一致率97.6％,阳性检出率比较差异无统计学意义(x2=0.10,P＞0.05);与显色培养基检测结果对比,一致性强(kappa=0.964),优于实时荧光PCR(kappa=0.952).结论 沙门菌属stn基因LAMP技术较实时荧光PCR敏感性强、特异性高,简便快速,对仪器设备要求不高,是一种适合口岸检验检疫部门使用的沙门菌快速检测方法.
关键词： 沙门菌属 环介导的恒温扩增技术 实时荧光PCR 沙门氏菌显色培养基 -
国境口岸疟疾快速联合检测方法应用评估
目的 对疟疾快速检测方法的联合应用进行评价,探索适用于口岸的疟疾快速检测方法.方法 选取来源于中国科学院寄生虫病研究所的疟原虫镜检阳性滤纸血样本,其中30例恶性疟,28例间日疟和20例正常人对照样本;同时使用检测疟疾的实时荧光PCR方法、交叉引物恒温扩增方法、胶体金技术对其进行检测；分析各方法检测的敏感性和特异性.结果 实时荧光PCR法检测恶性疟原虫的灵敏度高于交叉引物恒温扩增法和胶体金法(P值分别为0.019、0.043,P＜0.05))；对低原虫密度的恶性疟样本(原虫密度10～100及101～1 000个/μl),实时荧光PCR法检测的灵敏度较高,交叉引物恒温扩增法和胶体金法对于低原虫密度的恶性疟样本检测灵敏度显著低于PCR法；交叉引物恒温扩增和胶体金法联合检测在恶性疟各原虫密度下的灵敏度均高于使用单一方法的灵敏度,与实时荧光PCR法的灵敏度比较,差异无统计学意义(各原虫密度下,两者比较的P值分别为0.29、0.302、1.000、1.000,P＞0.05).实时荧光PCR法对间日疟样本检测灵敏度较高,交叉引物恒温扩增和胶体金法的灵敏度显著低于实时荧光PCR法,两者共检能提高检测的灵敏度.结论 交叉引物恒温扩增法和胶体金法联合检测,可以较好地筛选出各种原虫密度的感染者,该联合检测方法的灵敏度和特异性与实时荧光PCR法相当,适合国境口岸对疟疾现场快速检测的要求.
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国境口岸猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立
[目的]建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法.[方法]制备猴痘病毒阳性样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索佳反应条件.[结果]本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应.本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸.[结论]本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障我国的国境口岸卫生安全具有重要意义.
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Real-time PCR方法在致病性钩端螺旋体检测中的应用
目的 探讨实时荧光PCR (Real-time PCR)技术应用于致病性钩端螺旋体(钩体)快速检测的可行性.方法 以钩体rrs基因作为靶基因,合成1对引物和1条TaqMan探针,建立致病性钩体TaqMan Real-time PCR检测方法,进行灵敏性、特异性验证.用建立的方法对90份鼠肾样品进行检测,并与普通PCR方法进行比较.结果 建立的致病性钩体Real-time PCR检测方法线性关系较好,灵敏性比普通PCR高100倍,能特异性检出致病性钩体:对鼠肾样品的检测与普通PCR检测结果符合率为97.78％.结论 以rrs基因为靶基因建立的Real-time PCR方法时效性好、灵敏度高、特异性强,可用于致病性钩体的快速检测.
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纳米磁分离实时荧光PCR定量检测登革2型病毒
目的 建立一种登革2型病毒的快速提取和检测的方法.方法 根据登革2型病毒的基因保守区,设计一套特异的实时荧光PCR的引物与探针,设计一对引物用于构建定量检测的标准品,以建立登革2型病毒实时荧光定量PCR检测方法；选用纳米磁微粒,建立纳米磁分离提取登革2型病毒RNA的方法,并对其核酸提取效果进行评估.结果 纳米磁分离实时荧光PCR方法检测登革2型病毒具有快速、灵敏、特异的特点.在2.9× 102～2.9× 109 copies/μl的范围内循环阀值(Ct)值与病毒拷贝数的对数值存在线性关系(R2=0.99).结论 建立的纳米磁分离实时荧光定量PCR方法能够快速准确地检测登革2型病毒,在口岸卫生检疫中具有很好的应用价值.
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南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查
[目的]掌握南方口岸蚊媒携带病毒的本底资料,为蚊传疾病的预防控制工作提供依据.[方法]采用电动吸蚊器人工法和捕蚊磁场自动法采集南方5省口岸各类蚊虫.采集到的蚊类超低温送至实验室,研磨处理后用荧光PCR方法检测登革病毒、乙脑病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,结果阳性的标本进一步进行PCR扩增和核苷酸序列测定分析;蚊标本研磨液同时用C6/36细胞进行虫媒病毒分离培养,出现细胞病变后分别用黄病毒科、甲病毒科各自的通用引物进行鉴定;对未能鉴定的未知病毒进一步用随机PCR方法进行扩增、克隆、序列测定、Blast搜索.[结果]从南方5省口岸采集到各类蚊虫12575只,鉴定后共分成254组.各组标本经荧光PCR方法检测,结果登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒均为阴性;检测到2份福建省来源三带喙库蚊的标本乙脑病毒核酸阳性,经乙脑病毒E基因引物PCR扩增、测序分析证实为G Ⅰ型病毒.254份标本经C6/36细胞分离培养出现42份细胞病变,用黄病毒科、甲病毒通用引物PCR扩增,均未得到特异片段.选取1份典型病变的细胞培养物进行随机PCR鉴定,结果发现了1种潜伏于C6/36细胞中的浓核病毒.[结论]南方5省口岸蚊媒中可能未携带登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,只有少量蚊虫携带乙脑病毒,蚊虫体内检测到的G Ⅰ型乙脑病毒属于福建省首次发现,出现病变的C6/36细胞可能是由自身潜伏的1种C6/36细胞浓核病毒引起.
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科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立
目的 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法, 并在广东口岸进行应用.方法 分析埃博拉病毒基因组的同源性, 设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测.对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测, 确定佳的引物和探针组合、用量, 以及Mg2+用量, 建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析, 并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查.结果 经筛选, 引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对102105拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0％, 是佳的引物和探针组合.优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L, Mg2+终浓度为2 mmol/L.方法的灵敏度为50拷贝/ml, 重复性好、特异性强, 对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性.结论 建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高, 特异性强, 重复性好, 对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义.
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实时荧光PCR方法检测水产品中沙门菌
[目的]探索沙门菌快速检验法,加快水产品检验检疫通关速度,促进外经贸经济的发展.[方法] 用深圳太太基因工程有限公司提供的沙门菌实时荧光PCR试剂盒对水产品样本进行检验.[结果]用实时荧光PCR从多个水产品样品的增菌液中检出9份样品沙门菌阳性,用传统的微生物生理生化培养法从该9份样品中分离出9株沙门菌.根据血清分型、棚鉴定和荧光PCR结果,确认所分离的菌株中有沙门菌B群3株、Cl群4株、D群1株、其他群1株.[结论]实时荧光PCR方法在沙门菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势,有利于提高沙门菌的检出率,具有广阔的运用前景.
