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纳米磁分离实时荧光PCR定量检测登革2型病毒
目的 建立一种登革2型病毒的快速提取和检测的方法.方法 根据登革2型病毒的基因保守区,设计一套特异的实时荧光PCR的引物与探针,设计一对引物用于构建定量检测的标准品,以建立登革2型病毒实时荧光定量PCR检测方法；选用纳米磁微粒,建立纳米磁分离提取登革2型病毒RNA的方法,并对其核酸提取效果进行评估.结果 纳米磁分离实时荧光PCR方法检测登革2型病毒具有快速、灵敏、特异的特点.在2.9× 102～2.9× 109 copies/μl的范围内循环阀值(Ct)值与病毒拷贝数的对数值存在线性关系(R2=0.99).结论 建立的纳米磁分离实时荧光定量PCR方法能够快速准确地检测登革2型病毒,在口岸卫生检疫中具有很好的应用价值.
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登革1型和2型病毒混合感染样本的一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立
本文旨在建立检测登革1型和2型病毒的一步法实时荧光定量PCR方法,为登革热的诊断和预测提供技术支撑.依据登革1型和2型病毒的保守区序列设计引物和探针,建立了同时检测两个血清型登革病毒的一步法实时荧光定量PCR方法.特异性实验结果显示,该方法可检测出登1型和2型病毒,与登革3型、4型病毒、 黄热病毒、 流感H3 N2病毒均无交叉反应,具有较好的特异性.对登革1型和登革2型的灵敏度均为102 copies/μL.应用该方法,可检测出登革1型和2型病毒混合感染C6/36后不同时间点病毒复制动态.在两个血清型登革病毒混合感染C6/36细胞72～120 h登革2型病毒的拷贝数与单独感染时登革2型病毒的拷贝数相比显著下降.上述研究证实建立的一步法实时荧光定量PCR方法具有特异性好灵敏度高、 重复性好等特点,能够用于登革型和2型病毒混合感染样本的检测.
关键词： 登革1型病毒 登革2型病毒 一步法实时荧光定量PCR -
登革2型病毒E蛋白基因的酵母表达
为研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制,本研究对DENV-2的E蛋白基因进行了毕赤酵母分泌表达.首先,经RT-PCR方法克隆DENV-2的E蛋白基因,将克隆的基因与表达载体pPICZaB连接以构建表达重组子;并经酶切、PCR、测序筛选实验鉴定正确重组子.然后,重组子经氯化锂法转化毕赤酵母菌KM71H获得转化子;经抗生素、表型鉴定、PCR筛选得到Muts型的多拷贝转化子.后,经甲醇诱导基因表达,Western-blotting方法鉴定蛋白表达情况及佳表达时间.本研究对DENV-2的E蛋白成功进行了分泌表达,并且确定其表达佳发酵时间为96 h;为进一步研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制奠定了基础.
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云南省西南边境登革2型病毒全基因组序列特征研究
为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36 细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析.结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株.经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列.基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(Asian Ⅰ Genotype,AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype,CG).其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系.云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%~93.77%和92.80%~94.74%.所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变.本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家.云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化.
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登革2型病毒在C6/36细胞上受体蛋白的鉴定
应用VOPBA(病毒辅覆蛋白结合分析)技术,结合免疫印迹化学发光的方法在C6/36细胞上鉴定出了登革2型病毒唯一的大小约为35kDa的受体蛋白成分.为研究病毒对白纹伊蚊的感染机理打下了良好的基础.
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登革2型病毒在经口感染的白纹伊蚊不同个体体内分布的比较研究
本研究用石蜡切片和免疫组织化学技术,对白纹伊蚊经口感染登革2型病毒的分布定位进行了研究.白纹伊蚊感染登革2型病毒14天后,切片染色可直观地定位出病毒在蚊虫组织中的分布,比较不同蚊虫之间的染色可分为3种类型:1. 白纹伊蚊的中肠,唾液腺,复眼,神经节等较多组织呈阳性着色;2. 白纹伊蚊的中肠呈阳性,其它组织无阳性着色;3. 白纹伊蚊的中肠及其它组织均无阳性着色.以不同病毒滴度经口接种白纹伊蚊时,白纹伊蚊中肠,唾液腺的感染率和感染病毒滴度呈正相关.以上结果提示白纹伊蚊部分个体对登革2型病毒的感染存在中肠感染和中肠释放屏障,并且和感染病毒剂量有关.
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白纹伊蚊感染登革2型病毒后基因表达变化的研究
白纹伊蚊感染登革2型病毒24h后,和对照蚊虫一起提取RNA,用差异显示PCR(DDRT-PCR)技术对蚊虫感染病毒后基因表达的变化进行研究.白纹伊蚊感染登革2型病毒后,经过8条随机引物和3条3′端锚定引物配对扩增,发现了6条表达有差异的片段,其中5条为感染后表达量增加的片段,1条为感染后表达量减少的片段,并对这些片段进行了克隆和测序,通过GenBank查询,其中5条为未知序列,1条表达量增高的片段和果蝇核糖体蛋白S5基因有较高的同源性.这些差异片段的发现可能对探讨媒介蚊虫对登革病毒的易感性机理有意义.
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登革2型病毒贵州分离株NS1部分基因原核表达蛋白及其多克隆抗体制备
目的 原核表达、纯化DENV-2贵州分离株NS1部分序列表达蛋白,并制备其多克隆抗体以研究其功能.方法 合成DENV-2 M株NS1部分基因序列,克隆到原核表达载体pET28(a),转化大肠埃希菌BL21 (DE3)；用IPTG诱导表达,Ni柱亲和层析纯化、回收融合蛋白；用纯化融合蛋白免疫BALB/c鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价.结果 原核表达了NS1部分序列融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶800.Western blot检测该蛋白能被His标签抗体识别.结论 DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白可诱导小鼠产生较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究DENV-2M株NS1部分序列表达蛋白的免疫原性奠定了基础.
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不同地理株埃及伊蚊经口接种登革2型病毒的感染性研究
目的研究海南、广东、台湾和印尼Baro等4个地理株埃及伊蚊对登革2型病毒的感染情况.方法分别用鼠血和猪血配制不同病毒滴度的病毒混悬液经口接种埃及伊蚊,间接免疫荧光检测蚊脑液病毒抗原.结果用鼠血病毒混悬液时,印尼Baro株对登革2型病毒的感染率与海南株、台湾株的感染率差异有显著性(海南株:P=0.007 9＜0.01;台湾株: P=0.011 6＜0.05),与广东株的感染率差异无显著性(P＞0. 05),随着病毒滴度的下降,各株埃及伊蚊对病毒的感染率呈明显下降趋势;鼠血和猪血各株饱血雌蚊经口接种登革2型病毒的感染率差异无统计学意义(χ2=1.632 0, P=0.201 4＞0.05).结论不同地理株埃及伊蚊对登革2型病毒易感性存在差异.
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登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究
目的 为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,追踪传染源,为疾病的预防控制提供实验室依据.方法 对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒.采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析.结果 从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸,并分离到登革2型病毒;浙江省登革2型病毒分离株(ZJ/01/04)与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian/10/99株和Saudi/92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97.1%、99.2%和99.6%,而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.7%、66.9%和63.6%.基因进化树显示ZJ/01/04分离株与Saudi/92株亲缘关系近,在进化树的同一分支上.结论 从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起,该毒株有可能来源于沙特阿拉伯.
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登革2型病毒04株基因组全序列的测定
目的 对我国登革2型病毒04株(D2-04)基因组进行全序测定及分析,为了解其基因组结构与生物功能的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础.方法 根据登革2型国际标准株NGC的序列,设计13对重叠引物,通过RT-PCR扩增出D2-04株不同的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定.结果 D2-04株的基因组全长10723个碱基,从97到10269位为一个长的开放读码框,编码3391个氨基酸.将它与其它登革2型病毒株NGC、JAM、PR159 (S1)、16681及它的候选疫苗株PDK-53进行比较,其核酸序列同源性分别为95.0%、 97.6%、 89.8%、 93.8%和 93.7%,氨基酸序列的类似性分别为97.8%、 98.6%、 96.7%、 97.6% 和 97.5%.结论 我国D2-04株的基因组全序列基本类似于已发表的其它登革2型病毒株.在比较的5株登革2型病毒株中,D2-04株更类似于JAM株,其次是NGC株,与S1株的类似性略低.比较的结果表明,D2-04株与JAM株紧密相关,它们可能属于同一拓扑型.D2-04株全序的测定,对分析我国毒株来源及研制适于我国人群的登革疫苗具有一定意义.
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登革2型病毒全长cDNA克隆定点诱变的OL-PCR方法
目的对带有登革2型病毒(DEN-2)全长cDNA的质粒pDVWS501上E62、E203位点进行定点诱变. 方法设计4对点诱变引物,运用OL-PCR(overlap PCR)法,扩增出分别在E62或E203位带有点突变的2条DNA片段,克隆至T载体,获T-TB62、T-TB203两个克隆.将T-TB62用ClaⅠ和SphⅠ分别酶切,T-TB203用SphⅠ+NheⅠ酶切后,用T4连接酶分别连接至pDVWS501,获重组质粒TB62和TB203.对TB62和TB203进行序列测定. 结果成功得到分别在E62、E203位带有点突变的TB62、TB203克隆. 结论 OL-PCR法是具有较高突变效率的定点诱变方法.
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两株登革2型病毒E基因重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较
目的 用含登革2型病毒(Dengue type 2 virus,DEN2)B株和NGC株E基因部分序列pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 用两株含DEN2 E基因部分序列(1～476 bp)的pcDNA3.1重组质粒与含有佐剂的重组质粒共同免疫BALB/c小鼠,初次免疫后第14天、28天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第14、28、42、70和98天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血浆特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异性抗体水平.结果 不同DEN2毒株E基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类抗体的产生存在差异,B株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DEN2两毒株E基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.
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两株登革2型病毒NS1基因真核重组质粒免疫BALB/c小鼠产生特异性抗体水平的比较
目的 利用登革2型病毒(dengue type 2 virus,DENV2)M株和NGC株NS1基因部分扇列PcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠,观察免疫小鼠体液免疫应答的差异.方法 分别构建两株DENV2 NS1基因部分序列(1-413 bp)的PcDNA3.1真核重组质粒和pET28a(+)质粒,进行原核蛋白的表达、鉴定、纯化和定量;并用pcDNA3.1重组质粒免疫BALB/c小鼠,初次免疫及第7天、14天分别加强免疫1次,共免疫3次.收集初次免疫后第7、14、28和56天外周血标本,间接ELISA法测定小鼠血清特异性IgM/IgG类抗体水平,细胞病变抑制法检测特异保护性抗体水平.结果 构建了pET28a(+)-NS1m/pET28a(+)-NS1n原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,NS1基因部分序列获得表达,其相对分子质量均约22.3×103;Western blot表明该目的 蛋白可与抗His标签单克隆抗体结合;经Ni柱亲和层析法得到纯度达92%的表达蛋白,对C6/36细胞有毒性,并可用于ELASA检测.不同DENV2毒株NS1基因部分序列的pcDNA3.1重组质粒初次和加强免疫BALB/c小鼠诱导特异性IgM、IgG类和中和抗体的产生存在差异,M株重组质粒加强免疫小鼠后特异性抗体效价水平较高并持续较长时间.结论 DENV2两毒株NS1基因部分序列重组质粒免疫小鼠后诱生的特异性抗体类别、水平存在差异.
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登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用
目的:将我国登革2型病毒PrM(D2-PrM)基因导入甲病毒载体系统,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用.方法:采用体外转录和电穿孔的方法,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA,然后将这两种RNA共转染BHK细胞,进而包装成重组病毒颗粒.再将经激活的重组病毒感染宿主细胞,分别用不同型登革病毒攻击,然后通过免疫荧光法,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用.结果:含登革2型正、反义PrM基因的重组甲病毒,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制,而且对其他3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用.含反义PrM基因的重组病毒对4个型登革病毒复制的抑制作用强.结论:登革2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒,可介导对登革1～4型病毒复制的特异抑制作用.
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我国新近暴发的登革热的病原分离与鉴定
1999年8月在福建省福州等地突然暴发了大量人群原因不明的发热、关节疼痛、头痛、皮疹,个别患者出血等症状.该病起病急,传播迅速,发病人数达1 000多例.福建省卫生防疫站对此十分重视,要求对收集的患者血清标本进行鉴定.我们对所送标本进行了血清学、生物学及分子生物学检测,而且还观察了对动物的致病性.现将主要结果报告如下.
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体外转录法大量制备登革2型病毒RNA
登革病毒在复制过程中不形成DNA中间体,要在基因水平研究其特征存在一定的困难,因为突变、重组、克隆等分子生物学技术都是在DNA水平上的操作.体外转录制备感染性RNA(感染性转录体)技术提供了解决这一难题的新途径[1],它大致包括全长cDNA克隆的构建、体外转录和转染3个步骤.由于RNA易于降解,在转染敏感细胞时就需要大量的感染性转录体.本研究采用Promega公司的RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems,对带有登革2型病毒全长cDNA的质粒QH-04/MON501,TB62,TB203进行了体外转录.在对转录反应中各加入成分的比例进行调试后,能在体外大量制备登革2型病毒RNA.
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登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增
目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组.方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6 RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaI内切酶位点.从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增.以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段.结果长链RT-PCR法扩增出约11kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列.结论通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组,为进一步构建感染性克隆打下基础.
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两株登革2型病毒感染BALB/C小鼠特异性抗体产生动态的比较
目的:两株登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DV2)初次和再次感染BALB/C小鼠建立动物感染模型,对其产生特异性抗体进行动态观察,探讨感染DV2NGC株和DV2临床分离株(B株)引起的体液免疫应答的差异.方法:两株DV2毒株模拟自然感染途径,经皮下多点注射建立BALB/C小鼠感染动物模型;采用间接ELISA法检测感染动物血浆中抗DV2特异性IgM类抗体、IgG类抗体,并同时分离病毒观察病毒血症期的变化.结果:不同DV2毒株初次、再次感染BALB/C小鼠后诱导特异性Ig产生的类别存在差异,且DV2B株再次感染动物后表现为病毒血症期相对延长.结论:两株DV2诱导特异性抗体产生的动态与病毒血症期不同.
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登革2型病毒体外诱导Ana-1巨噬细胞极化及其TLR7表达的研究
目的:研究登革2型病毒体外诱导Ana-1细胞极化及TLR7表达情况,分析其在登革病毒致病过程中的可能作用.方法:用DEN2感染Ana-1细胞,24、72、120小时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测病毒核酸、iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12p40 mRNA;Western blot检测iNOS、Arg-1、TLR7蛋白;双抗体夹心ELISA法检测TNF-α水平.结果:巨噬细胞被DEN2感染后病毒核酸在72小时达峰值,2-ΔΔCt值为159.98±37.80;iNOS mRNA及蛋白表达明显上升(P＜0.05),IL-12p40 mRNA、TNF-α水平显著升高(P＜0.05),72小时达峰值;IL-12p40 mRNA 2-ΔΔCt值为11.1±2.41,TNF-α浓度为(454.72±13.41)pg/ml.Arg-1 mRNA及蛋白较M2型极化对照组降低(P＜0.05);IL-10 mRNA与正常对照组无显著差异(P＜0.05);TLR7表达低于同期正常对照组.结论:Ana-1细胞被DEN2感染后向M1型极化;DEN2可下调Ana-1细胞TLR7表达,可能是DEN2发生免疫逃逸的机制之一;Ana-1细胞 TNF-α水平与细胞内DEN2核酸呈正相关.
