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登革2型病毒E蛋白基因的酵母表达
为研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制,本研究对DENV-2的E蛋白基因进行了毕赤酵母分泌表达.首先,经RT-PCR方法克隆DENV-2的E蛋白基因,将克隆的基因与表达载体pPICZaB连接以构建表达重组子;并经酶切、PCR、测序筛选实验鉴定正确重组子.然后,重组子经氯化锂法转化毕赤酵母菌KM71H获得转化子;经抗生素、表型鉴定、PCR筛选得到Muts型的多拷贝转化子.后,经甲醇诱导基因表达,Western-blotting方法鉴定蛋白表达情况及佳表达时间.本研究对DENV-2的E蛋白成功进行了分泌表达,并且确定其表达佳发酵时间为96 h;为进一步研究登革病毒与蚊虫相互作用的分子机制奠定了基础.
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微小隐孢子虫P23抗原在重组干酪乳杆菌中的分泌表达及其免疫原性
本实验以微小隐孢子虫 Cryptosporidium parvum 子孢子抗原P23基因和信号肽基因Usp45为材料,构建干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 中分泌表达P23蛋白的重组载体pMG-Usp45-P23.在培养物上清和细菌裂解组分中,分别以SDS-PAGE、Western blotting、IFAT和ELISA等不同方法检测P23蛋白的分泌和表达情况,并用已获得的P23蛋白分泌产物体外刺激Wistar大鼠淋巴细胞,评价其淋巴细胞转化活性.结果表明,分别在细菌培养物上清和破碎菌体组分中检测到大小约为20 kDa(不含信号肽)和23 kDa (含信号肽)的P23蛋白分泌和表达产物.并且该P23蛋白分泌产物与ConA相当,具有显著的淋巴细胞转化活性.本实验为进一步研制动物微小隐孢子虫 C.parvum 活菌疫苗载体的构建奠定了基础.
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杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定
目的 在毕赤酵母中分泌表达具有抗菌活性的杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4(CP1-DS4). 方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化Cecropin P1和Dermaseptin S4两抗菌肽基因序列,通过SOE-PCR拼接,构建克隆载体pMD18T-cp1-ds4并测序;pMD18T-cp1-ds4经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后构建重组表达载体pPICZαA-cp1-ds4,测序验证开放阅读框(ORF)正确后经SacⅠ线性化处理,然后电转化毕赤酵母X-33(800V,1mm电转化杯,15s电击1次)并利用Zeocin筛选阳性重组子.重组子接种BMGY、BMMY培养基,采用5％的甲醇诱导表达,采用Tricine-SDS-PAGE分析表达上清,表达上清浓缩后进行抑菌试验. 结果 在本研究中拼接引物经SOE PCR拼接后得到优化的长度为120bp的Dermaseptin S4基因基因片段,该片段与Cecropin P1基因连接形成约197bp杂合抗菌肽片段,成功构建pPICZdA-cp1-ds4表达载体,电转化获得重组酵母菌pPICZαA-cp1-ds4/X-33,经诱导后可产生分子质量单位约为9.7 ku的目的多肽,该多肽对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌均有抑制作用. 结论 杂合肽CP1-DS4可以在毕赤酵母X-33中融合分泌表达,且具有抗菌活性.
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细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及生物学功能鉴定
目的 在毕赤酵母中分泌表达细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Echinococcus granulosus thioredoxin per-oxidase,EgTPx),并检测其抗氧化活性. 方法 从包囊中分离原头蚴,抽提总RNA,采用RT-PCR获取EgTPx的cD-NA片段并克隆至分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K-EgTPx,电穿孔法转化毕赤酵母菌株GSll5,在MD平板上筛选His+克隆,采用梯度浓度G418抗性筛选高拷贝转化子,提取酵母基因组DNA,采用PCR鉴定Mut表型,阳性克隆经甲醇诱导表达EgTPx蛋白,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定,并检测其抗氧化活性. 结果 酶切和测序证实重组表达质粒pPIC9K-EgTPx构建正确,表达的目的蛋白分子质量单位约为22 ku,该蛋白可被鼠抗EgTPx多抗识别,且具有较强的抗氧化活性. 结论 在毕赤酵母表达系统中成功表达了EgTPx,该蛋白具有免疫反应性和抗氧化活性.
关键词： 细粒棘球绦虫 硫氧还蛋白过氧化物酶 毕赤酵母 分泌表达 抗氧化 -
重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达
目的 构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的 蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定.方法 从 pET-22b/pUOX 重组质粒上 PCR 获得 pUOX基因,然后通过重叠延伸 PCR 技术将 pUOX 与一段 nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体 pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌 WB800中.结果 发酵表达后胞外分泌液经 SDS-PAGE 检测,在约34 kD 处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致.发酵液中该重组蛋白的酶活力达 2.322 U/ml.结论 成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的 蛋白分泌表达并具有较高活性.
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人源性抗HBsAg单链抗体在大肠埃希菌中分泌表达条件的研究
目的 研究抗HBsAS单链抗体A-15在大肠埃希菌中的高效表达,增加该抗体在培养基中的产量.方法 改变工程菌的诱导时机、诱导剂浓度和诱导时间,以观察这些因素对单链抗体表达的影响.另外,加入不同浓度的蔗糖、甘氨酸和Triton X-100,以考察三种化学物质对单链抗体在培养基中分泌量的影响.结果 工程菌培养4 h后,加终浓度0.5 mmol/L IPTG诱导表达8 h为抗HBsAS单链抗体A-15较佳的表达条件.终浓度0.3 mol/L蔗糖,2%甘氨酸和1%Triton X-100同时加入诱导时的培养基中,可使培养基中表达的单链抗体亲和活性分别增加16.78倍.经测定抗HBsAg单链抗体A-15在培养基中终表达量为7.4 mg/L.结论 抗HBsAg单链抗体A-15的分泌表达条件得到优化,表达量明显提高,这为更有效地制备该抗体用于其结构和功能研究提供了一个切实可行的方法.
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新型佐剂蛋白TFPR1在毕赤酵母系统中的表达及鉴定
目的：利用毕赤酵母系统表达一种基于蛇毒蛋白triflin的致病相关蛋白1( PR-1)功能区蛋白 TFPR1。方法从质粒 pUC57-TFPR1中 PCR 扩增目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-TFPR1,转染入巴斯德毕赤酵母野生型X33菌株,经甲醇诱导表达重组蛋白TFPR1,采用ELISA法筛选阳性菌株后,SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果重组表达质粒pPICZαA-TFPR1经双酶切和测序鉴定证明构建正确；重组蛋白以分泌形式表达,相对分子质量约16×103。结论利用巴斯德毕赤酵母表达系统成功表达TFPR1蛋白,为进一步研究其功能和作为佐剂的应用提供参考资料。
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AChRα211的分泌表达及其对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用
目的在毕赤酵母(P. pastoris)中分泌表达AChRα211,研究其对重症肌无力患者血清中AChRAb的清除作用. 方法以质粒pUC-AChRα211为模板,PCR扩增人AChRα211 DNA 片段,插入真核表达载体pPIC9K中.重组质粒转入P. pastoris GS115后,经甲醇诱导分泌表达AChRα211,用Sepharose Q离子交换柱和Superdex 75分子排阻层析进行纯化.Western blot 和ELISA进行免疫活性分析后,将目的蛋白偶联于CNBr-Sepharose 4B树脂上,研究该免疫吸附剂对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用. 结果双酶切鉴定和序列分析表明,AChRα211 DNA片段已正确插入到pPIC9K载体中.重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-AChRα211经甲醇诱导可分泌表达目的蛋白AChRα211,经阴离子交换柱和分子排阻层析可得95%纯AChRα211,并制备成免疫吸附剂.Western blot 和ELISA分析表明,重组蛋白具有与天然AChRα亚基相似的免疫活性.免疫吸附实验表明该重组蛋白可特异性地去除肌无力患者血清中的AChRAb. 结论在P. pastoris中分泌表达并纯化重组蛋白AChRα211,制备成一种新的免疫吸附剂AChRα211-Sepharose,可清除肌无力患者血清中的AChRAb.
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以lacZ作为报告基因研究霍乱弧菌irgA基因表达的铁调控性
细菌蛋白分泌表达基因水平的调控与许多环境信号密切相关，铁浓度作为环境信号影响许多基因的表达。irgA为霍乱弧菌中铁抑制外膜蛋白，在乳鼠模型中检测irgA突变株毒力下降100倍。鉴于irgA的可诱导表达，其启动子在可调控高效表达外源基因方面可能会发挥较好的作用。本研究用启动子探测质粒、以lacZ作为报告基因对irgA在大肠杆菌工程菌中的铁浓度调控表达方面进行了初步的定量研究。
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重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定
目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验.方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性.结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg.结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性.
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羧肽酶A1全酶及其肽段的分泌表达及活性测定
抗体导向酶一前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy,ADEPT)自1987年由Bagshawe等提出以来,其研究受到广泛关注[1-2].
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白芍总苷对骨关节炎软骨细胞增殖及分泌表达的影响
目的 研究白芍总苷(TGP)对人骨关节炎软骨细胞(HOCs)增殖、凋亡、分泌表达的影响及其作用机制,为白芍总苷在骨关节炎洽疗方面提供初步的实验依据.方法 组织块法培养原代人骨关节炎软骨细胞;TGP处理人骨关节炎软骨细胞并培养12、24和48 h;采用CCK-8检测细胞存活率;ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)以及Caspase-3表达水平;Western blotting检测Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、金属蛋白酶组织抑制剂-1 (TIMP-1)和核转录因子κB(NF-κB)的蛋白表达水平.结果 TGP能促进细胞增殖,并存在时间和浓度依赖性,其中8μmol/L TGP作用24 h时细胞存活率高,存在显著性差异(P ＜0.05);TGP可以显著抑制凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达,并促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达(P＜0.05);TGP可以显著降低与软骨退化相关的MMP-13/TIMP-1比值(P＜0.05);TGP可以抑制炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8表达(P ＜0.05);TGP可以抑制NF-κB的表达(P＜0.05).结论 TGP促进人骨关节炎软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡、降低MMP-13/TIMP-1比值以及炎症因子的分泌,其机制可能是与抑制NF-κB的表达相关.
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HCV NS5A反式激活基因 NS5ATP13在毕氏酵母中的表达研究
目的 探讨NS5AATP13能否在毕氏酵母中成功表达.方法 用Bst X I将pPICZαANS5ATP13线性化后,电转化毕氏酵母菌株KM71H,用Zeocin筛选高拷贝数的酵母菌落,在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达,以甲醇诱导,30℃培养4 d,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 分析.结果 预期分子量大小的NS5ATP13蛋白分泌至培养液.结论 NS5ATP13在毕氏酵母中成功表达.
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胎盘功能与子痫前期的研究进展
胎盘具有物质合成、交换、代谢以及防御功能,是维持胎儿在子宫内生长发育的重要器官,亦是调节母体与胎儿大环境平衡的特异性器官.当发生胎盘功能不全时,即失去了这个平衡状态[1].子痫前期与胎盘功能不全有着密切的联系,胎盘缺血缺氧是子痫前期发病的重要环节,该观点目前已被广泛认可.正常妊娠10周时,绒毛外滋养细胞延螺旋小动脉逆行侵润,逐渐取代血管内皮,血管肌肉弹力层被纤维素样物质取代,致使管腔扩大阻力降低血流增加,此过程为螺旋动脉血管重铸,若重铸不全,管腔狭窄,即为胎盘"浅着床",导致胎盘缺血缺氧[2].胎盘功能不全,胎盘源性生理物质分泌调节异常,导致新陈代谢、炎性反应、血管生成的调控异常,促使子痫前期的发生.目前胎盘分泌表达的蛋白、酶等物质,已成为子痫前期发病机制的研究热点,现就胎盘分泌物质与子痫前期的关系进行综述.
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A型肉毒毒素保护性抗原在酵母细胞中的表达与抗原性分析
目的:在酵母系统中实现A型肉毒毒素(BoNTa)Hc基因的可溶性分泌表达.方法:将Hc基因克隆入表达载体pPIC9K,用SacⅠ将重组质粒线性化,电转化巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115细胞,筛选G418抗性阳性整合子,进行Mut+表型株甲醇快速利用诱导.结果:经过体外高拷贝整合子的筛选和诱导表达条件的优化,毒素Hc在pH 6.5培养基 BMMY中实现稳定的分泌表达,终筛选到蛋白表达量占上清蛋白10%的分泌高表达株.免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组BoNTa Hc可以识别特异抗肉毒马血清并具良好的特异结合活性,可以诱导小鼠产生特异性抗体.结论:酵母系统来源的具有良好免疫原性的重组BoNTa保护性抗原可以作为有效的候选重组疫苗分子.
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人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆表达及活性鉴定
目的 获得高表达人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的工程菌.方法 采用RT-PCR技术从人胃组织总RNA中分离扩增了hCu/Zn-SOD的cDNA序列,将该基因重组到T7启动子控制下的分泌型表达载体pET22b(+)中,构建了表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达.采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析其活性.结果 该工程菌可高表达一相对分子质量大约16kD的蛋白,与抗人Cu/Zn-SOD多克隆抗体有特异的免疫反应,表达量可达菌体可溶性蛋白的20%以上,且具有特异性SOD酶活性.结论 该菌株分泌表达了有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,为大量制备hCu/Zn-SOD和下一步研究工作奠定了基础.
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鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性研究
目的 研究鲨肝活性肽S-8300的克隆、分泌表达及重组产物活性.方法 根据从鲨鱼肝脏中分离纯化到的S-8300的N端氨基酸序列,设计了一套简并引物,利用RT-PCR方法从再生鲨肝组织的总RNA中扩增到一条cDNA片段,大小为342 bp.结果 根据序列分析及氨基酸序列推测的结果,表明这个cDNA片段的N端与S-8300 N端15个氨基酸序列完全一致,genebank和NCBI的搜索结果表明这个cDNA片段是一个新的序列.将这个cDNA片段插入到信号肽pelB基因下游,成功构建了原核分泌表达质粒pET22b-S,将该质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中成功构建了工程茵pET22b-S/BL21(DE3).通过对重组茵诱导条件(诱导温度、诱导剂IPTG的浓度)的筛选,SDS-PAGE分析,结果表明,在25℃,0.4 mmol·L~(-1)IPTG诱导条件下,S-8300在信号肽pelB引导下能够高效的分泌至周质腔中.结论 活性研究表明,该分泌表达产物具有与天然S-8300相似的减轻链脲霉素对NIT-1细胞损伤的作用.
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人SM22α在巴斯德毕赤酵母中的表达、纯化及抗体制备
目的:用酵母表达重组人平滑肌22α(SM22α)蛋白,制备兔抗人SM22α多克隆抗体.方法:利用PCR从pGEM3z-SM22α质粒扩增得到人SM22α基因编码区,重组至pPIC9构建酵母表达载体,转染巴斯德毕赤酵母,进行分泌型表达.表达产物经分步盐析和CM-纤维素柱层析纯化后,免疫家兔,制备兔抗人SM22α多克隆抗体.结果:所构建的pPIC9-SM22α酵母表达载体转染酵母感受态细胞后,外源性SM22α可整合至酵母染色体中,经甲醇诱导84 h,可实现SM22α的高效表达与分泌.用70%硫酸铵处理上清液,收集沉淀进行离子交换层析纯化后,经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一分子量为22 kD的单一区带.用该纯化产物免疫家兔制备的兔抗人SM22α抗血清可用于检测人或大鼠血管壁中SM22α的表达水平.结论:重组人SM22α可在巴斯德毕赤酵母中进行高效表达与分泌,纯化蛋白可用于抗体制备,为研究SM22α功能提供了检测工具.
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水蛭素基因工程菌的培养条件优化
通过正交实验对水蛭素基因工程菌的发酵培养基进行了优化,并由此得到较佳培养基配方为玉米浆4.5%,牛肉膏2.5%,谷氨酸钠1.5%;以此优化培养基在初始PH6.5,种龄12小时和温度37℃等条件下,摇瓶发酵液水蛭素活力可达到1200ATU/ml.
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TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测
目的 构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺.方法 人工合成反式激活蛋白(TAT)序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用.结果 重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的大抑制率为83.95％.结论 成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性.
