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高产尿酸氧化酶乳酸工程菌的构建
目的 将尿酸氧化酶基因克隆到乳酸乳球菌(Llactis)NZ9000中,使之能启动nisA放大系统增加尿酸氧化酶活性,构建一株高效分解尿酸的基因工程菌.方法 根据GenBank上已知的产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因序列(Uricase,E12709)设计引物,PCR扩增尿酸氧化酶基因片段,将其克隆入质粒PNZ8048、PMG36e,构建重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U,重组质粒电转化L.lactis NZ9000构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组菌体裂解液中的尿酸氧化酶,测定尿酸氧化酶的活性和在高尿酸患者血清中降解尿酸的能力.结果 构建的重组质粒PNZ8048-U、PMG36e-U经酶切和测序显示,尿酸氧化酶基因片段长度为0.9 kb,基因片段序列与GenBank上尿酸氧化酶基因序列完全一致.构建重组基因工二程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U、L.lactis NZ9000-PMG36e-U,均表达相对分子质量约为34 000的重组蛋白,与从尿酸氧化酶基因序列推测的303个氨基酸的理论分子量相符.体外测定菌酶液活性,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组酶活性为(1.92±0.14)u/ml,产朊假丝酵母菌组酶活性为(0.55±0.05)u/ml,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组酶活性为(0.29±0.06) u/ml.高尿酸血症患者血清培养结果显示加入生理盐水的对照组尿酸值(620.0±58.7) μmol/L,L.lactis NZ9000-PNZ8048-U组(321.0±46.2) μmol/L,L.lactis NZ9000-PMG36e-U组(568.0±47.3)μmol/L,产朊假丝酵母菌组(406.0±42.4)μmol/L,其他3组与对照组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 成功构建基因工程菌L.lactis NZ9000-PNZ8048-U,重组菌酶活性较基因来源菌产朊假丝酵母菌高,并可高效分解高尿酸患者血清中的尿酸.
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重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达
目的 构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的 蛋白的分泌表达,并对其酶活性进行测定.方法 从 pET-22b/pUOX 重组质粒上 PCR 获得 pUOX基因,然后通过重叠延伸 PCR 技术将 pUOX 与一段 nprB信号肽基因相连,导入穿梭载体 pP43X,构建重组载体pP43X/pUOX,运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌 WB800中.结果 发酵表达后胞外分泌液经 SDS-PAGE 检测,在约34 kD 处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致.发酵液中该重组蛋白的酶活力达 2.322 U/ml.结论 成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌,目的 蛋白分泌表达并具有较高活性.
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猪尿酸酶动力学特性研究
目的 研究作用温度、pH值、底物浓度对猪尿酸酶催化反应速度的影响,和猪尿酸酶的热稳定性、酸碱稳定性、保存的稳定性及Kin值.方法通过测定不同温度、pH值、不同底物浓度等反应条件下尿酸酶的活性来确定其适反应条件和酸碱稳定性.测定酶制剂在37℃和70℃保温不同时间后的残余活力,确定尿酸酶的热稳定性.测定酶制剂在4℃和加入不同比例的甘油后并在-20℃保存一定时间后的残留活力,确定尿酸酶保存的稳定性.用Lineweaver Burk法作图确定酶的Km值.结果在一定的条件下,该猪尿酸酶的适作用温度是37℃,适pH为8.4,而且pH在7.0以上活性保持稳定.热稳定性较好,在37℃处理48h时活性保持62.7%,在70℃处理1 h时活性仍保持17%.在适温度及pH条件下,底物浓度在0～30μmol/L酶活力上升明显,30-120 μmol/L 酶活力上升较缓慢,120～200μmol/L,酶活力无明显上升,故该猪尿酸酶达到大反应速度的底物浓度应在120 pmol/L.尿酸酶在4℃中保存2个月活性保持82.4%,加入20%甘油后在-20℃保存的稳定性好,2个月后活性仍保持92.8%.通过底物浓度与酶活力计算得到该酶催化尿酸的米氏常数(Km)为8.03μmo/L.结论该猪尿酸酶的理化性质较优越,适作用温度及反应佳pH接近人体生理条件,热稳定性和酸碱稳定性都较好,与底物的亲和力好,且易于保存,为该酶的临床应用提供了实验依据.
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羟苯磺酸钙对尿酸酶－过氧化物酶偶联法尿酸检测的干扰研究
目的：探讨羟苯磺酸钙对市售7种尿酸酶－过氧化物酶偶联法尿酸（ UA）检测系统的干扰及对临床的影响。方法配制含不同浓度羟苯磺酸钙的干扰样本，终干扰样本中药物终浓度分别为0、2、4、8、16、32、64μg／ml。用7种尿酸酶－过氧化物酶偶联法检测系统以及1种尿酸酶－紫外法UA系统分别测定UA，计算与药物浓度为0时的百分偏差。监测了志愿者服药前后不同时间（实验前、0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h）血清中羟苯磺酸钙和UA浓度的变化。以LC－IDMS／MS法作为参考，比较了不同检测系统的干扰程度。采用HPLC法测定40份服药患者血清中羟苯磺酸钙浓度，选择其中10份血清，比较过氧化物酶偶联法和紫外法UA系统测定UA的偏差以评估临床状态影响。结果在体外添加实验中，当血清中羟苯磺酸钙浓度为16μg／ml时，7种尿酸酶－过氧化物酶偶联法UA测定值与药物浓度为0时的偏差在－6．3％～－21．2％之间。志愿者服药后1 h，2 h，3 h，4 h，6 h血清UA采用过氧化物酶偶联法测定值与0 h相比偏差分别为－3．33％，－6．79％，－7．49％，－6．07％，－4．09％。志愿者服药0 h和2 h血清中UA采用7种过氧化物酶偶联法UA系统的检测值与LC－IDMS／MS法相比的平均偏差分别在－3．75％～－6．89％和－14．0％～－20．13％。结论羟苯磺酸钙对7种尿酸酶－过氧化物酶偶联法UA检测系统均产生明显负干扰，且不同检测系统受干扰程度有显著差异。临床患者服药期间，若采用酶法测定UA值可导致假性降低。（中华检验医学杂志，2015，38：600－604）
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尿酸氧化酶的表达纯化及活性形式鉴定
目的:在大肠杆菌内表达具有活性的黄曲霉尿酸氧化酶.方法:用重叠PCR从黄曲霉(Aspergillus flavus)3.1398中钓取了尿酸氧化酶(urate oxidase,UO,EC 1.7.3.3)基因,克隆到原核表达载体pET22b中,转化大肠杆菌 BL21(DE3),筛选到高表达的重组转化子菌株.经乳糖诱导目的蛋白表达,阴离子交换柱纯化,获得纯品.SDS-PAGE分析样品纯度.用尿酸缓冲液测定酶活性,用戊二醛交联结合质谱法测定相对分子质量.结果:目的蛋白为胞内可溶性表达,表达量达菌体总蛋白的35%,纯化后的样品纯度达 99%,其酶比活力可达35 U/mg.经质谱测定重组UO单体的相对分子质量为34×103.交联后相对分子质量为160×103.结论:黄曲霉尿酸氧化酶可在大肠杆菌中可溶表达,并具有活性,其活性形式为四聚体.
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抗高尿酸血症药物研究进展
痛风是一种代谢性疾病，危害严重，近年来患病率呈上升趋势。尿酸排泄减少或生成增多所致的高尿酸血症是痛风的主要病因，而高尿酸又与多种疾病密切相关。降低血尿酸水平是治疗痛风，预防痛风复发的重要措施。目前，抗高尿酸血症药物主要有3类，分别是黄嘌呤氧化酶抑制剂、尿酸盐阴离子转运蛋白1（URAT1）抑制剂和尿酸氧化酶类似物。对现有抗高尿酸血症药物的现状以及研究进展进行总结，希望对其研发提供参考。
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医生小词典--尿酸氧化酶
尿酸氧化酶（尿激酶）是存在于尿中的一种蛋白水解酶，其主要作用是激活血纤维蛋白溶酶原（纤溶酶原）成为有活性的血纤维蛋白溶酶（纤溶酶），从而使血纤维蛋白凝块（血栓）溶解。目前，尿酸氧化酶主要从男性尿液中抽提纯化。尿液中尿酸氧化酶含量极低，10吨尿液只能分离出约1公斤的尿酸氧化酶。尿酸氧化酶可供药用，目前认为其对治疗脑血栓、心肌梗死等有良好的疗效。急性心肌梗死者冠状动脉内使用尿酸氧化酶与链激酶，两者促进阻塞冠状动脉的开放作用相当，治疗后的病死率和发病率相一致。另外，尿酸氧化酶不具抗原性，可重复使用。
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尿酸氧化酶静脉溶栓治疗急性脑梗死临床观察
目的:观察尿酸氧化酶静脉溶栓治疗急性脑梗死的临床疗效.方法:将发病时间小于24 h的脑梗死患者随机分为治疗组与对照组.治疗组29例,男21例,女8例,平均年龄(51.2±10.1)岁,静脉滴注国产尿酸氧化酶150万U.对照组30例,男14例,女16例,平均年龄59.84岁,每日静脉滴注脉通500 mL,连用14 d.观察两组3 h、6 h、12 h、24 h、14d、21 d及28 d神经功能缺损评分及临床疗效.结果:治疗组28 d神经功能缺损评分低于对照组(P＜0.05),治疗组临床有效率86%高于对照组63%,且有统计学差异(P＜0.05).结论:尿酸氧化酶静脉溶栓治疗脑梗死安全、有效.
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重组链激酶与尿酸氧化酶治疗急性心肌梗死的疗效比较
目的:比较重组链激酶和尿酸氧化酶治疗急性心肌梗死(AMI)的疗效和安全性.方法:选取符合急性心肌梗死患者66例,分别给予尿酸氧化酶或重组链激酶150万U加入0.9%氯化钠100 mL中,30 min内滴完,12 h后子低分子肝素皮下注射,观察溶栓疗效.结果:再通率:尿酸氧化酶组62.8%,重组链激酶组87.1%;6 h再通率:尿酸氧化酶组75%,重组链激酶组95.6%,结果均有显著差异;副作用:重组链激酶组主要为寒战,两组均有轻度出血.结论:应用重组链激酶溶栓再通率高,安全性好.
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液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键
目的 采用液质联用法分析重组假丝酵母尿酸氧化酶的二硫键数量及存在方式.方法 将重组假丝酵母尿酸氧化酶分别进行烷基化及变性后烷基化处理,液质联用法测定未处理及两种不同方法处理后的尿酸氧化酶的平均相对分子质量,根据测定结果判断其二硫键数量及存在方式.结果 未处理样品的平均相对分子质量为34 076.80,表明该蛋白以单体形式存在,不存在链间二硫键;直接烷基化样品平均相对分子质量为34 133.40,仅有一个游离巯基被烷基化;变性后烷基化样品的平均相对分子质量为34 304.80,4个游离巯基全被烷基化,蛋白不存在链内二硫键.结论 重组假丝酵母尿酸氧化酶中的4个半胱氨酸未形成链间及链内二硫键.
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尿酸氧化酶临床疗效和安全性评价
血尿酸水平升高会引起高尿酸血症,尿酸氧化酶能将尿酸分解进而降低血尿酸水平.近年来,随着生物技术的发展,尿酸氧化酶作为分解尿酸的生物制剂已被批准上市,但其有效性和安全性还有待进一步研究和评估.此文对近年用于治疗高尿酸血症的上市尿酸酶类药品及其临床应用疗效和安全性进行综述,并对尿酸氧化酶应用存在的问题和今后的研究方向做了展望.
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重组尿酸氧化酶对动物高尿酸血症的治疗作用及安全性研究
目的 探索重组尿酸氧化酶对动物高尿酸血症的治疗作用,并评价其安全性.方法 通过给予乙胺丁醇和腺嘌呤或黄嘌呤,建立小鼠高尿酸血症模型,并考察尿酸氧化酶的降血清尿酸作用;选取猕猴进行3月长期毒性研究,使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猕猴毒性试验给药结束及恢复期后抗体的产生情况.结果 重组尿酸氧化酶可显著降低小鼠的尿酸水平;猕猴的长期毒性试验未发现与药物相关的明显毒性反应;猕猴体内检获相关抗体,恢复期后产生抗体的比例大大降低.结论 重组尿酸氧化酶对动物高尿酸血症具有显著治疗作用,猕猴的安全剂量大于3.2 mg/kg.
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促进尿酸分解药物的疗效与安全性评价
目的：对目前临床常用的促进尿酸分解药物的疗效与安全性进行评价；方法：对近年来国内外的相关文献进行检索、分析、分类和整理；结果：目前临床应用的促尿酸分解药物主要有拉布立酶、普瑞凯希等，临床试验及临床后用药试验均证明其降尿酸作用确切，该类药物的主要不良反应为免疫原性反应，其他常见不良反应包括发热、恶心、头痛、心血管事件及便秘等；结论：虽然多数研究证明促尿酸分解药物具有确切的降尿酸作用，但由于目前应用的尿酸酶均为低等生物的尿酸酶，较强的免疫原性及相对高昂的价格限制了其在临床的广泛应用，研发人尿酸酶或者与人亲缘关系更近的高活性尿酸酶是今后尿酸酶研发的重要方向。
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微创伤颅内血肿碎吸术治疗高血压脑出血的效果
①目的观察微创伤颅内血肿碎吸术治疗高血压脑出血的效果.②方法根据头颅CT平片行筛板三维定位,采用锥颅反复碎吸或抽吸,生理盐水置换冲洗后放入引流管并注入尿酸氧化酶等治疗高血压脑出血病人82例,并与内科常规方法治疗82例的效果进行比较.③结果治疗组总有效率为70.73%,对照组为47.56%,两组总有效率比较差异有显著性(χ2＝9.10,P＜0.01);神经功能缺损评分治疗组治疗第1,7,14,21天均优于对照组,差异有显著性(t=3.77～8.02,P＜0.05).④结论微创伤颅内血肿碎吸术治疗高血压脑出血效果显著.
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尿酸氧化酶与低分子肝素联合治疗急性脑梗死的效果
①目的观察尿酸氧化酶与低分子肝素联合治疗脑梗死效果.②方法治疗组58例用尿酸氧化酶与低分子肝素治疗,对照组44例用甘露醇和维脑路通、胞二磷胆碱治疗,于治疗后3周观察疗效.③结果治疗3周时治疗组神经功能缺损积分较对照组明显减少(t=2.54,P<0.01),两组疗效比较差异有显著性(u=3.39,P<0.01).④结论尿酸氧化酶与低分子肝素联合治疗急性脑梗死疗效肯定,可防止再梗死.
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小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死的临床效果
①目的探讨小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死的效果.②方法将106例急性脑梗死病人随机分为治疗组56例,对照组50例.对照组应用脱水剂、活血化淤、脑保护剂及抗凝剂等治疗.治疗组在对照组的基础上加用小剂量尿酸氧化酶治疗.③结果在治疗后24h,治疗组与对照组的临床评分差异无显著性(F=2.17, P> 0.05).治疗后7d,30d临床评分,两组差异有显著性(F=4.66,q=12.11,9.87,P<0.05;F=6.23,q=17.83,11.91,P<0.05);6h以内与7～24h溶栓治疗在7d,30d的临床评分也有显著性差异(q=7.29,8.16,P<0.05).④结论小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死在临床上有一定的疗效,并且安全、方便.溶栓时间越早效果越好.
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东菱克栓酶治疗急性下肢深静脉血栓形成的效果
目的观察东菱克栓酶治疗急性下肢深静脉血栓形成的效果.②方法将129例住院病人随机分为东菱克栓酶治疗组和尿酸氧化酶对照组,观察两组病人用药前后的临床疗效,同时比较两药对血液流变学及血管再通的影响.③结果东菱克栓酶治疗组疗效优于尿酸氧化酶对照组(u＝2.584,P＜0.05);血管再通率亦高于对照组(u＝4.061,P＜0.05).④结论东菱克栓酶是治疗急性下肢深静脉血栓形成的有效药物.
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尿酸氧化酶双注法治疗全脑室出血23例临床分析
1996年1月～2000年1月,我院应用双侧脑室穿刺引流及腰穿注入尿酸氧化酶的方法,治疗全脑室出血病人23例,效果满意,现报告如下.1 临床资料1.1 一般资料本组23例病人中,男16例,女7例;年龄17～72岁,平均58岁.22例有高血压病史,1例术后经DSA检查为脑血管畸形.本组病人均经脑CT检查确诊,根据刘玉光等[1]脑室出血分级方法:Ⅱ级(6～10分)3例,Ⅲ级(11～15分)17例,Ⅳ级(16～20分)3例.
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静脉溶栓治疗急性心肌梗死的并发症分析
1996～1999年,我科静脉溶栓治疗急性心肌梗死(AMI)62例,现就其并发症分析如下.1 临床资料1.1 一般资料本组62例病人中,男45例,女17例;年龄33～70岁,平均57.6岁.
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uPA与uPAR在肾细胞癌中的表达及其意义
①目的探讨尿酸氧化酶(uPA)、尿酸氧化酶受体(uPAR)在肾细胞癌中的表达特征及其在肾癌恶性生长中的作用.②方法选取40例不同分化程度及临床分期的肾细胞癌组织和10例正常肾组织,采用Supervision法进行免疫组织化学染色,检测uPA、uPAR的表达.③结果 uPA、uPAR的表达程度与肾癌细胞分化程度及临床分期有关,分化越差、临床分期越晚,则表达程度越高.在肿瘤细胞增殖密集区域,uPA、uPAR阳性的肿瘤细胞比例较低,而在肿瘤细胞生长稀疏、肿瘤血管增殖旺盛的区域,阳性细胞比例较高.正常肾组织未见uPA、uPAR的表达.④结论 uPA、uPAR的表达是浸润性生长的肾细胞癌的特征之一,其表达程度可作为判断肾癌浸润性的重要参考指标之一.uPA、uPAR的表达对肾细胞癌血管发生可能起重要作用.
