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血浆同型半胱氨酸水平与慢性肾功能衰竭的相关性
同型半胱氨酸是蛋氨酸(HCY)代谢过程中形成的含硫基氨基酸,80%的 HCY 在血中通过二硫键与蛋白结合,只有很少一部分游离同型半胱氨酸参加循环,HCY 水平与心血管疾病密切相关,是心血管疾病发病的一个重要危险因子,血液中增高的 HCY 因为刺激血管壁引起动脉血管的损伤,导致炎症和管壁斑块的形成,终引起心脏血流受阻.
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风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对其细胞融合活性的影响
为了探讨风疹病毒包膜糖蛋白E1中二硫键对风疹病毒细胞融合活性的影响,在构建重组载体pBSK-SPE2E1的基础上,利用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法,构建了11个突变体,分别将E1外功能区的11个半胱氨酸残基突变为其它氨基酸残基,从而去除一个二硫键,利用Giemsa染色法定性检测由此引起的细胞融合情况,流式细胞术检测导入的外源DNA在细胞表面的表达效率,血吸附检测重组表达的突变体蛋白的受体识别活性.结果表明E1外功能区的10个二硫键对RV的细胞融合活性都有重要影响,任何一个二硫键的去除均导致E1的细胞融合活性丧失;其中第5和第8个半胱氨酸残基所形成的二硫键与E2和E1的相互作用有关,第3、第4和第13个半胱氨酸残基所形成的二硫键可能直接影响E1的细胞融合功能.
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蛋白巯基的氧化还原修饰与心血管功能调节
细胞内局部环境氧化还原状态的生理范围变化可通过蛋白所含特定半胱氨酸巯基与二硫键之间产生可逆性转换参与广泛信号转导过程,而过度氧化即氧化应激则导致巯基不可逆地性转化为亚磺酸与磺酸产物,导致蛋白功能损伤.本文将讨论近年来在蛋白巯基的氧化还原反应及调节机制的研究以及与心血管功能调控关系的进展.
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沙眼衣原体二硫键异构酶DsbG分子伴侣活性研究
主细胞、变性CS复性及EB感染宿主细胞形成包涵体中的作用.结果 EB与宿主细胞接触前与重组融合蛋白DsbG作用30 min后,吸附宿主细胞的能力较对照组增强,吸附的宿主细胞数量与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);同时,DsbG能大大缩短CS的复性时间;DsbG对37℃热处理的裸EB有保护作用,与对照组比较,感染HeLa229细胞形成包涵体的数量提高32%.结论 重组融合蛋白DsbG可以促进EB的吸附、感染宿主细胞HeLa229和加速CS复性,在EB感染宿主细胞过程中可能有分子伴侣作用.
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脑源性神经营养因子研究进展
脑源性神经营养因子（ BDNF）是继神经生长因子之后第二个被发现的神经营养因子［1］，是一类分子量为12.3 kD的碱性蛋白质，由119个氨基酸残基构成，并含有3对二硫键，在体内以二聚体的形式存在，主要分布在中枢神经系统，其中以海马及皮层组织中含量高，另外在外周组织如心脏、肺、肌肉中也检测到BDNF的存在。 BDNF不但对多种类型神经元的发育、分化以及神经的生长和再生起着维持和促进作用，而且在神经元损伤后的再生修复和防止神经细胞退行性变等多方面也发挥着重要作用。自1989年被克隆以来， BDNF的生物学作用受到国内外广泛的研究［2］，并发现其与多种疾病的发生、发展和治疗有关。
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层粘连蛋白-5γ2链Ⅳ功能区基因克隆及蛋白表达
层粘连蛋白-5(LN-5)是层粘连蛋白家族中一员,是1个α3、β3和γ2 3条多肽链经二硫键结合的"Y"字型糖蛋白分子.该蛋白在皮肤修复与移植、肿瘤发生与迁徙中起重要作用,遗传性大疱性表皮松懈症(JEB)与该多肽链结构的基因突变有关[1-3].γ2链IV功能区对LN-5分子在细胞黏附过程中起关键性作用[4].为探讨该功能区是否为LN-5小黏附功能单位,是否可替代LN-5检测指标,本研究构建含γ2链IV功能区基因克隆载体,并对该蛋白进行原核表达.
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两种浓度的二硫苏糖醇对抗体区分试验结果的影响
对新生儿溶血病及同种抗体检测,抗体区分试验是必不可少的.运用巯基类试剂可裂解IgM分子的二硫键,使其失去原有的血清性质,来检测共存的IgG抗体.观察抗体用巯类试剂处理前后的活性,对于免疫球蛋白性质的确定非常重要[1].目前经典方法之一采用0.01 MDTT(二硫苏糖醇)溶液处理血清标本.但该浓度的试剂在某种情况不能使IgM分子完全降解,直接影响免疫球蛋白性质的确定.为此,我们对单位时间内不同浓度的试剂(0.01 mol、0.02 mol)对IgM抗体破坏结果及各项指标进行了比较,旨在探讨试剂浓度与IgM抗体的关系.
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血管加压素在感染性休克及心肺复苏时的应用
1 VP的生理及病理生理血管加压素(VP)是由下丘脑视上核和室旁核的神经内分泌细胞合成并分泌,贮存在垂体后叶,此外上交叉、杏仁核、海马等处也可有少量分泌.VP是由9个氨基酸组成的,通过二硫键构成的环状结构,分为精氨酸加压素(AVP)和赖氨酸加压素(LVP)二种,人为AVP,猪为LVP.高渗透压和细胞外液量减少是促进AVP合成分泌的有效的刺激.此外,疼痛、外伤、情绪变化、吗啡、巴比妥等药物均可影响AVP的分泌.AVP的生理范围是0.3～30 pg/ml,一般在4 pg/ml以下,禁水时渗透压增高,可于48小时升高至30～40 pg/ml.手术、大出血等应激状态下可超过600 pg/ml.AVP半衰期15～20分钟.
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二硫键共价载紫杉醇胶束对乳腺癌的抑制作用
目的 通过体内外实验评估二硫键共价载紫杉醇胶束[P(PEGMEA)-co-P(PDPHEMA)-g-PTX,简称二硫键紫杉醇]对乳腺癌的抑瘤效果.方法 (1)用0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、50、100、500μg/ml二硫键紫杉醇溶液分别处理MCF-7细胞,用MTT法检测在490 nm波长处的吸光度值(D),并计算药物的半数抑制浓度(IC50).(2)用10μg/ml胶束、紫杉醇及二硫键紫杉醇分别处理4种细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U937),用MTT法检测在490 nm波长处的D值,并用流式细胞仪评估MDA-MB-231细胞凋亡情况.(3)利用MDA-MB-231细胞构建荷瘤裸鼠模型.选择荷瘤裸鼠18只,随机分为胶束组、紫杉醇组、二硫键紫杉醇组3组,每组6只,分别给药5 mg/kg;另选18只,随机分为3组,每组6只,胶束组给药16 mg/kg,紫杉醇给药5 mg/kg,二硫键紫杉醇给药16 mg/kg(载药率30.9％,含紫杉醇5 mg/kg).分别记录肿瘤体积及重量,检测血常规,对肿瘤及重要内脏器官行病理检查.多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法;若数据不满足正态分布和方差齐性,用M(P25～P75)表示,采用非参数检验进行分析.结果 (1)二硫键紫杉醇对MCF-7细胞活力抑制作用呈浓度依赖关系(IC50=6.13μg/ml).(2)在MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U937细胞系,3组(胶束组、紫杉醇组、二硫键紫杉醇组)的D值比较,差异均有统计学意义(F=133.152、139.673、17.364、14.900,P均<0.050),两两比较中紫杉醇组、二硫键紫杉醇组分别与胶束组比较差异均有统计学意义(P均<0.050),但二硫键紫杉醇组与紫杉醇组比较,差异无统计学意义(P=0.091、0.071、0.188、0.616).胶束组、紫杉醇组、二硫键紫杉醇组的MDA-MB-231细胞凋亡率分别为46.35％(45.20％～52.38％)、45.60％(45.03％～46.93％)、11.70％(11.00％～12.60％),差异有统计学意义(P=0.003).胶束组与紫杉醇组,胶束组与二硫键紫杉醇组间比较差异均有统计学意义(P均<0.017);紫杉醇组与二硫键紫杉醇组比较差异无统计学意义(P=0.423).(3)给荷瘤裸鼠注射5 mg/kg相应药物后,胶束组、紫杉醇组、二硫键紫杉醇组肿瘤体积分别为(5465±1105)mm3、(3590±877)mm3、(4125±792)mm3,差异有统计学意义(F=7.264,P=0.005),肿瘤质量分别为(6.29±1.31)g、(3.62±1.03)g、(4.58±0.92)g,差异也有统计学意义(F=10.167,P=0.001);紫杉醇组与二硫键紫杉醇组在肿瘤体积和质量方面的差异均无统计学意义(P=0.345、0.296).胶束组给药16 mg/kg,紫杉醇给药5 mg/kg,二硫键紫杉醇给药16 mg/kg后,裸鼠肿瘤体积分别为(3251±679)mm3、(1936±399)mm3、(1637±371)mm3,差异有统计学意义(F=16.100,P<0.001);肿瘤质量分别为(3.02±0.48)g、(2.00±0.18)g、(2.00±0.18)g,差异也有统计学意义(F=18.147,P<0.001);紫杉醇组与二硫键紫杉醇组在肿瘤体积和质量方面的差异均无统计学意义(P=0.385、1.000).紫杉醇组裸鼠在给药2周后开始精神萎靡,活动量减少并死亡2只,其余2组裸鼠状态较好.3组裸鼠的红细胞、白细胞及血小板数量比较,差异均无统计学意义(F=1.424、1.845、2.257,P=0.276、0.197、0.144).HE染色结果显示,紫杉醇组和二硫键紫杉醇组肿瘤组织内均可见广泛坏死灶.结论 二硫键紫杉醇胶束在体内外对乳腺癌细胞具有与紫杉醇相似的抑制作用,不良反应小,且有效抑制剂量更低.
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新A超家族芋螺毒素Bt14．10的克隆及合成研究
目的：从我国南海西沙附近海域的桶形芋螺（Conus betulinus）中克隆出新型A-超家族芋螺毒素Bt14．10，并利用化学方法合成该毒素，鉴定其二硫键连接方式。方法提取桶形芋螺毒腺管基因组DNA，基于非翻译区及内含子序列设计合成引物进行PCR，获得Bt14．10的序列。采用Fmoc-固相法合成线性肽Bt14．10，通过空气氧化折叠获得含二硫键的折叠产物，利用两步折叠法测定其二硫键连接方式。结果发现一种新的A超家族芋螺毒素DNA序列Bt14．10，其编码的成熟肽序列为CAHSVPGMHPCKCNNTC-NH2，二硫键连接方式为“C1-C3，C2-C4”。结论 BT14．10是一种新型A超家族芋螺毒素，具有A超家族芋螺毒素较为少见的ⅪⅤ型半胱氨酸骨架结构。
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外源蛋白在大肠杆菌中的折叠
大肠杆菌是表达外源基因常用的宿主之一.它结构简单,遗传背景清楚,基因表达调控机制相对明确.随着对分子伴侣和折叠酶研究的深入,蛋白在大肠杆菌内的折叠机制逐渐为人们所认识.外源蛋白在大肠杆菌内的可溶性表达问题也逐步得到解决.
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氯化血红素-空气催化氧化体系应用于利那洛肽的合成
目的 使用氯化血红素催化氧化的方法合成利那洛肽.方法 采用9-芴甲氧头羰基(Fmoc)固相合成策略,以Wang树脂为载体和三苯甲基(Trt)为保护基的半胱氨酸合成利那洛肽线性肽,使用氯化血红素-空气催化氧化体系一步氧化法构建3对二硫键,并与传统的空气、二甲基亚砜和碘(I2)氧化法进行了对比.结果和结论 相对于传统氧化法,氯化血红素催化氧化法可更快速、更高效地得到目标利那洛肽,为多肽合成中的二硫键形成提供一种新的方法.
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还原响应型药物载体的研究进展
还原响应型药物载体以其高效快速释放药物、毒副作用小、可生物降解的优良特性,逐渐成为药物载体领域研究的热点,也是具临床应用潜力的智能药物载体之一.本文综述了还原响应型药物载体研究的新进展,包括还原响应的药物、基因与载体的偶联物及还原响应的纳米聚合物胶束、纳米囊泡、纳米中空微球、纳米脂质体等的合成和药物释放的机制以及各类载体的优缺点,为其在药剂学中的进一步应用提供理论依据.
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具有还原敏感可断裂的疏水尾链的新型阳离子脂质用于siRNA递送的研究
为了获得更高的转染效率和更低的毒性,本研究合成了一种新型的人字形阳离子脂质 (2ss HLL),它由亲水性天冬氨酸和两条还原敏感可断裂的疏水油酸尾链组成.通过siRNA和基于2ss HLL的脂质体间的静电相互作用,成功制备了粒径约150 nm的均匀的球形阳离子纳米复合物.从评估结果可以看出,该纳米复合物在Hep G2细胞试验中表现出较好的细胞摄取和较低的细胞毒性.RT-PCR分析结果表明,2ss HLL/si EGFR纳米复合物可表现出与Lipofectamine2000相类似的对靶mRNA显著的下调效应.这些增强的siRNA基因沉默效率可能归因于还原响应性断裂所诱导的疏水尾链的分离.在还原环境中观察到的纳米复合物的粒径和siRNA释放的变化也证实了上述的机制.由此,我们认为氧化还原响应型2ss HLL将有可能成为siRNA递送的潜在纳米载体.
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应用串联质谱技术分析几种重组蛋白药物的翻译后修饰
目的 应用串联质谱技术对几种重组蛋白药物的翻译后修饰进行分析.方法 首先将这几种蛋白分别进行蛋白酶切形成多肽片段,然后液相色谱-质谱联用测定其液质肽图,后应用串联质谱技术分析几种蛋白的翻译后修饰信息.结果 分别对这些蛋白中存在的二硫键、相对分子质量相似肽段、O-糖基化位点以及N-糖基类型等翻译后修饰进行了分析确证.结论 串联质谱技术可在一定程度上弥补蛋白酶切的不足,为重组蛋白药物翻译后修饰的分析提供更加充分的证据.
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前阳离子脂质体的构建及有关性质研究
目的 制备前阳离子脂质体并考察其相关性质.方法 化学合成含二硫键的胆固醇衍生物(2-[[4-[(羟甲基)二硫]-1-亚氨丁基]氨基]乙基]氨基甲酸胆固醇酯,CHETA);薄膜分散-膜挤压法制备空白前阳离子脂质体;以鱼精蛋白缩合质粒DNA再与空白前阳离子脂质体作用,形成载基因前阳离子脂质体;粒度电位测定仪测定前阳离子脂质体的粒径和Zeta电位,电镜观察形态;考察在二硫键还原酶二硫苏糖醇的作用下前阳离子脂质体Zeta电位变化情况;以LacZ为报告基因转染HepG2细胞,X-gal原位染色定性观察,并定量测定β-半乳糖苷酶活性和总蛋白含量计算转染效率.结果 前阳离子脂质体形态近似于球体,平均粒径为145.8 nm(PDI=0.086),Zeta电位为-33.83 mV,载基因前阳离子脂质体转染肝癌细胞HepG2转染效率为12.18 mU·mg-1 protein,是裸质粒的10.5倍.结论 二硫键修饰的前阳离子脂质体是具有发展潜力的非病毒载体.
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还原敏感型聚合物胶束在肿瘤靶向药物递送中的应用
目的 介绍还原敏感型聚合物胶束在肿瘤靶向药物递送方面的研究进展.方法 当前肿瘤化疗药物普遍存在疗效低和副作用大的缺点,肿瘤微环境敏感的靶向治疗已成为重要的研究领域之一.以国内外研究文献为基础,分类介绍了还原敏感型聚合物胶束的结构特点,并分别从细胞水平和动物水平综述了其在肿瘤靶向药物递送中的应用.结果与结论 利用肿瘤细胞内部的还原性环境,制备还原敏感型聚合物胶束,可实现有效控制药物释放,毒副作用小,体内外疗效好的特点,具有很好的发展和应用前景.
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重组人白介素-15理化对照品的分析鉴定
目的 为了对产品质量进行有效的控制,根据《中国药典》要求,对重组人白介素-15理化对照品进行分析鉴定.方法 参照2010年版《中国药典》三部,测定该样品的生物学活性、蛋白含量、纯度、等电点等指标;通过测定N-末端氨基酸序列、质谱相对分子质量与液质肽图,确证其一级结构.结果 该样品的比活性为1.03×107 IU·mg“;蛋白含量为(0.879±0.065) mg·mL-;非还原SDS-PAGE纯度为100.0％;分子排阻色谱纯度为100.0％;等电点测定结果为5.2;以上结果均符合质量标准要求.实测质谱相对分子质量(12 900.80)与理论值(12 900.71)一致;氨基酸序列与理论一致,氨基酸覆盖率100％;二硫键连接方式为Cys36-Cys86、Cys43-Cys89,与文献报道相符.结论 该理化对照品质量合格、氨基酸序列正确,可用于白介素-15的常规质量控制.
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我国已上市重组人促红细胞生成素的一级结构比较
目的 对我国已上市的重组人促红细胞生成素的一级结构进行比对分析.方法 针对9家制药企业生产的重组人促红细胞生成素理化对照品,测定质谱相对分子质量、液质肽图、寡糖图谱及唾液酸含量,并对测定结果进行比对分析.结果 各样品去除N-糖基后实测相对分子质量均与理论值一致,误差均小于1;液质肽图测定中氨基酸覆盖率均为100％,序列均与理论一致;二硫键连接方式均为Cys7-Cys1 61、Cys29-Cys33;O-糖基化位点均为Ser 126,N-糖基化位点均为Ash24、Asn38、Asn83;各样品的糖基修饰方式存在差异,不同糖型的相对比例不一致;唾液酸含量测定结果介于(物质的量的比11.5～15.7)促红细胞生成素之间.结论 9家EPO制品的一级结构基本一致,差异主要表现在糖基修饰水平.
关键词： 一级结构 重组人促红细胞生成素 糖基化 二硫键 -
二硫键稳定的双特异diabody的构建及表达
目的:在双特异diabody中设计和引入二硫键结构,提高其稳定性.方法:在抗HBsAg/RBC双特异diabody表达载体中分别将抗HBsAg或抗RBC抗体的轻重链可变区基因适当部位进行突变,引入半胱氨酸残基,使diabody结构中形成共价键.大肠杆菌中分泌表达或包含体表达.结果:使抗HBsAg/RBC双特异diabody的热稳定性和在尿素中的稳定性得到了较大程度的提高,改善了diabody的性能.结论:证明了diabody二硫键模型的可行性.
