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凋亡素诱导细胞凋亡的机制及其在肿瘤治疗中的应用
凋亡素是由鸡贫血病毒的vp3基因编码的一种13.6kD的蛋白质,这种蛋白质具有广谱抗肿瘤特性,能特异性诱导细胞转化或肿瘤细胞凋亡.本文就凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制及其在肿瘤治疗中的应用作一综述.
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凋亡素选择性抗肿瘤的分子机制
凋亡素(apoptin)是一种来源于鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子量蛋白.CAV是一种无囊膜的DNA病毒,其基因组为2300 bp的单链环状DNA分子,含有3个完全或部分重叠的开放读码框,分别编码3个蛋白质:VP1、VP2和VP3[1].VP1为主要的衣壳蛋白,相对分子质量51 600.VP2为非结构蛋白,相对分子质量24 000,其具有双重性质的磷酸酶活性并且主要与VP1相互作用.VP1与VP2为CAV复制所必需[2].VP3亦称为凋亡素,相对分子质量13 600,能选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡,如骨肉瘤、肝癌、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等,而不杀伤正常细胞[1,3-5].
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凋亡素在人体消化道肿瘤中的作用
细胞凋亡是细胞在其基因的调控下有序的死亡方式,是生物细胞的一种生理性死亡过程,对于维持整个机体的正常生理过程、保证个体正常发育起着重要作用.一旦细胞的增生和/或凋亡异常,均可导致细胞的恶性转化.凋亡素(VP3)来源于鸡贫血病毒,由366 bp组成,编码121个氨基酸序列的小分子物质,能够特异性诱导肿瘤细胞的凋亡,不依赖于p53,同时Bcl-2不仅不能抑制其活性,而且具有加速VP3诱导凋亡的作用,令人兴奋的是VP3对正常的人和鼠的二倍体细胞无任何毒副作用,其原因在于VP3特异性的核定位及其磷酸化所致.多种载体(细菌或质粒)具有独特的安全性能和/或免疫佐剂作用,经过分子生物学改造以后,能够表达外源基因并具有生物学活性,可以作为VP3释放系统,利用VP3在正常细胞和肿瘤细胞以及转化细胞中定位的不同以及VP3激酶在肿瘤细胞和正常细胞中表达的差异,对癌前病变或易于癌变的细胞进行检测,对预测肿瘤发生的倾向性和肿瘤的治疗具有重要的意义.因此VP3在抗肿瘤方面具有巨大的潜在优势和广阔的应用前景,对VP3进行深入细致的研究可能为恶性肿瘤的治疗开辟一条新的、有效的、安全的途径.
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凋亡素对R-OS-732细胞骨架的影响
目的研究凋亡素(apoptin,VP3)对骨肉瘤OS-732多药耐株(R-OS-732)细胞骨架的影响及生长抑制作用.方法将VP3基因克隆入载体pIRESI,获得重组质粒pIRV3;脂质体法转染R-OS-732细胞;制作细胞骨架标本.结果实验组细胞骨架网状结构减少,浓聚,分布不均;对照组细胞骨架网状结构脉络清晰,舒展,分布也相对均匀.结论凋亡素对R-OS-732细胞生长具有抑制作用并导致细胞骨架破坏.
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分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响
目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.
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改良型TAT-VP3基因表达对人膀胱癌细胞凋亡的诱导作用
VP3来源于鸡贫血病毒(CAV),又被称为凋亡素[1].TAT能够跨膜导入细胞内部.我们利用分子克隆方法构建了重组质粒PcDNA3-TAT-VP3,观察改良型TAT-VP3基因在人膀胱癌BIU-87细胞中的表达及诱导凋亡的效应.
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双特异性抗肿瘤重组腺病毒对前列腺癌细胞的抑制作用
目的 探讨结合肿瘤特异性启动子hTERTp和特异性抑癌基因Apoptin的腺病毒AdhTERTp-E1 a-A poptin (Ad-VT)对前列腺癌PC-3细胞的抑制作用. 方法 于96孔板内制备前列腺癌PC-3单层细胞(5×103个/孔),分别用100个感染复数(multiplicity of infection,M OI)、10 MOI和1 M0I的重组腺病毒Ad-VT、Ad-CMV-Apoptin(Ad-VP3)、Ad-hTERTp-El a-EGFP (Ad-GT)和Ad-CMV-EGFP(Ad-EGFP)进行感染,以未感染孔为对照,每个剂量设3个复孔.采用96 h噻唑盐(MTT)法,检测重组腺病毒对PC-3细胞的抑制作用.于6孔板制备PC-3单层细胞(1 × 106个/孔),分别用100 MOI的Ad-VT、Ad-VP3、Ad-GT和Ad-EGFP感染PC-3细胞,培养48 h后,分别应用AO/EB染色法、DAPI染色法、Annexin V检测法对PC-3细胞进行染色,在显微镜下观察细胞形态,分析Ad-VT对PC-3细胞的抑制方式；应用Caspase检测法对PC-3细胞提取总蛋白,检测Caspase酶活性,分析Ad-VT对PC-3细胞的抑制方式. 结果 MTT法结果显示除Ad-EGFP外,Ad-VT、Ad-VP3和Ad-GT均 不同程度地表现出对PC-3细胞的抑制作用,其中Ad-VT、Ad-GT的抑制作用强于Ad-VP3,差异有统计学意义(P＜0.05)；培养48、72、96 h,随着MOI的增高,Ad-VT对PC-3细胞的抑制作用具有一定剂量效应关系趋势,感染剂量为100 MOI时,Ad-VT对PC-3细胞的抑制作用具有一定时间效应关系趋势.通过AO/EB、DAPI、Annexin V检测法和Caspase酶活性检测结果显示,Ad-VT可通过诱导PC-3细胞的凋亡抑制PC-3细胞的增殖.其中AO/EB染色可观测到经Ad-VT感染的PC-3细胞呈现橘红色；DAPI染色可观测到经Ad-VT感染的PC-3细胞细胞核呈现亮蓝色,且存在核内物质碎裂；Annexin V检测法可观测到经Ad-VT感染的PC-3细胞出现磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加等凋亡特征；Caspase检测结果显示Ad-VT可明显上调Caspase2、3、6、8、9酶的活性. 结论 结合肿瘤特异性启动子hTERTp和特异性抑癌基因Apoptin的腺病毒Ad-VT通过细胞凋亡能有效地抑制前列腺癌PC-3细胞的生长.
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抗DR4和抗DR5单抗在肿瘤治疗中的研究进展
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),或称凋亡素2配体是近几年发现的肿瘤坏死因子(TNF)的超家族成员[1].DR4和DH5是TRAIL的死亡受体(death receptor,DR),属于TNF受体超家族.
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凋亡素基因对人喉癌细胞Hep-2的抑制效应研究
鸡贫血病病毒(chicken anemia virus,CAV)主要以诱导细胞凋亡方式破坏宿主细胞,VP3基因被认为是CAV的主要功能基因,其具有细胞核定位信号域和DNA结合域,能够以非p53依赖性途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无作用,且其凋亡诱导作用不受Bcl-2的抑制,相反Bcl-2还能增强其功能[1].
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凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡
目的:克隆凋亡素(apoptin)的全长基因,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡.方法:从CAV病毒基因组TK5803中通过PCR技术扩增凋亡素基因,直接克隆至真核表达载体 pCDNA3.1/His/Topo,序列测定证实其正确性,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体.采用脂质体转染HeLa细胞,转染3 d后Honchest33258染色并于荧光显微镜下观察细胞状态.结果与讨论:核酸序列分析证实所克隆的凋亡素基因与文献报道的一致,将其成功克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo 和pCIneo,构建了真核重组质粒pCIneo-apoptin和pCDNA3.1/His/Topo-apoptin, 转染HeLa细胞3 d后可见明显的细胞凋亡,而只转染空质粒的对照组则较少.表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡.本研究为进一步研究凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制打下了基础.
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穿膜肽凋亡素融合蛋白诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究
目的 探讨新型细胞穿膜肽hPP10和凋亡素Apoptin融合蛋白介导小鼠黑色素瘤细胞B16凋亡的效应.方法 构建pET15b-hPP10-Apoptin、pET15b-Apoptin原核表达质粒,经IPTG诱导和NI-NTA树脂纯化后得到融合蛋白;运用TUNEL法体外检测hPP10-Apoptin诱导B16细胞的凋亡效应;制备荷瘤小鼠模型,并在体内检测hPP10-Apoptin融合蛋白的抗肿瘤能力.结果 融合蛋白hPP10-Apoptin经Western blot鉴定正确,且此融合蛋白能在体内外有效诱导B16黑色素瘤细胞凋亡.结论 新型细胞穿膜肽hPP10可有效携带Apoptin穿透细胞膜并发挥抗肿瘤作用.
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Apoptin引起肿瘤细胞G2-M阻滞
目的:研究凋亡素(apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用,探讨其用于肿瘤治疗的可能性.方法:用PCR技术克隆了apoptin基因,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体,观察转染pcDNA3.1/FLAG/apoptin和/或Ad/apoptin重组腺病毒感染后apoptin在几种细胞中的表达及细胞形态的改变,用流式细胞术分析PI染色后Ad/apoptin感染细胞的DNA含量变化.结果:apoptin在Hela、Bcap37、A549、HepG2、SKOV3等肿瘤细胞核中表达,apoptin重组腺病毒感染后细胞核染色质呈颗粒状,后凝聚成不规则大块并出现核固缩.正向和反向插入apoptin的重组腺病毒均引起G2-M细胞增多,但前者引起G2-M阻滞更为显著,需要的感染复数(MOI)也较低.结论:apoptin可引起肿瘤细胞周期G2-M阻滞和染色质凝聚.
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改良型TAT-凋亡素融合蛋白的制备及活性检测
目的:制备并检测改良型TAT-Apoptin 融合蛋白的抗肿瘤活性.方法:将前期诱导表达的改良型TAT- 凋亡素融合蛋白,用GST 亲和层析柱纯化并经Lowry 法测定其蛋白浓度.用CCK-8 法检测EJ 细胞的抑制率.结果:纯化后的改良型TAT-Apoptin 融合蛋白能有效抑制膀胱癌EJ 细胞生长.结论:改良型TAT-Apoptin 融合蛋白在体外能有效抑制膀胱癌EJ 细胞的生长.
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凋亡素体外抗膀胱癌效应观察及应用前景分析
目的:观察凋亡素诱导不同膀胱癌细胞株凋亡的效果并结合文献评价其临床应用前景.方法:采用凋亡素原核表达载体pBV220/Apoptin、真核表达载体PCDNA3、人膀胱移行细胞癌细胞株BIU-87及EJ、RT-PCR试剂盒以及质粒提取试剂盒.将原核表达载体中的Apoptin基因克隆入真核表达载体PCDNA3,经双酶切及基因测序鉴定无误后,利用脂质体转染法将真核表达质粒PCDNA3/Apoptin转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ.然后于转染后24h利用RT-PCR观察基因表达情况,并分别于转染后24、48、72h利用透射电镜检测肿瘤细胞超微结构变化、MTT法检测细胞存活率、流式细胞仪TUNAL法检测各组细胞的凋亡率,并对结果行统计学分析.结果:成功构建真核表达载体PCDNA3/Apoptin并转染膀胱癌细胞株BIU-87及EJ.转染24h后,通过RT-PCR法可见凋亡素基因在细胞内表达,并于转染后不同时段观察到实验组细胞发生高效凋亡,并随时间的延长而逐步升高,转染后72h,两种细胞株的凋亡率约为65%,而MTT法所测细胞存活率约为25%.与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).同时通过透射电镜可观察到实验组多数细胞出现凋亡的超微结构变化,如核边集、核碎裂及凋亡小体等.结论:凋亡素可诱导不同的膀胱癌细胞株发生高效的凋亡.考虑到其具有与小分子化疗药物不同的作用机制,我们认为凋亡素有可能成为克服膀胱癌细胞多药耐药性的新途径之一.
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凋亡素体外诱导表达Survivin膀胱癌细胞凋亡效果观察
目的:观察凋亡素对表达Survivin膀胱癌细胞株的作用效果,并结合相应机制探讨其临床意义.方法:利用免疫组织化学法检测膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin的表达水平,并计算平均每高倍镜视野中阳性细胞比率.将肿瘤细胞分为单纯细胞组、转染空质粒pCDNA3组及转染pCDNA3/Apoptin组,利用脂质体转染法将真核表达栽体pCDNA3/Apoptin及pCDNA3空质粒转染入膀胱癌细胞中,并于转染后24h通过RT-PCR法检测细胞中Apoptin的表达情况.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,并利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率.结果:利用免疫组织化学法检测发现膀胱癌细胞株BIU-87中Survivin呈高表达状态,平均每个高倍镜视野中阳性细胞比例约70%,并有较多细胞呈现高表达状态.转染后24h通过RT-PCR法可见Apoptin在膀胱癌细胞中表达.分别于转染后24、48、72h利用MTT法检测各组细胞存活率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞存活率均明显低于对照组,差别有统计学意义(P<0.05);利用流式细胞仪TUNEL法检测各组细胞的凋亡率,发现转染pCDNA3/Apoptin组肿瘤细胞凋亡率均明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05).结论:凋亡素可在体外诱导高表达Survivin的膀胱癌细胞株BIU-87高效凋亡,结合相关机制表明凋亡素可在一定程度上克服Survivin的抗凋亡作用,因此有可能成为Survivin拮抗的抗肿瘤药物的协同用药选择.
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构建HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物及对乳腺癌细胞增殖的影响
背景：凋亡素(Apoptin)能诱导50种以上不同类型的肿瘤细胞凋亡，有望成为一种极具应用前景的抗肿瘤制剂。如何安全、有效地将其应用于临床，是一个亟待解决的具现实意义的问题。
目的：拟制备人血清白蛋白(HSA)与Apoptin基因的复合物，通过体内外实验验证其抗瘤效果，为Apoptin尽早应用于基因治疗寻找一个简单有效的转移方式。
方法：①构建含Apoptin基因的真核表达载体pcDNA-Apoptin。以水溶性碳二亚胺(EDC)为交联剂，将聚醚酰亚胺(PEI)与人血清白蛋白(HSA)连接，合成HSA-PEI复合物，然后经电荷中和效应将HSA-PEI复合物与pcDNA-Apoptin重组体及pcDNA空载体分别连接，形成相应HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物；②将HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物转染乳腺癌MCF-7细胞，Western blot检测Apoptin基因在细胞中的表达，MTT法和流式细胞术检测转染后细胞增殖情况；③建立裸鼠乳腺癌模型，使用尾静脉注射法，分别将0.5 mL HSA-PEI-pcDNA-Apoptin、HSA-PEI-pcDNA及生理盐水注射入裸鼠体内，4周后测量肿瘤体积。
结果与结论：①成功构建并鉴定了HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物，体外成功转染乳腺癌MCF-7细胞；②HSA-PEI-pcDNA-Apoptin转染MCF-7细胞24 h有Apoptin蛋白的表达，而转染HSA-PEI-pcDNA细胞及空白对照组细胞未见Apoptin蛋白的表达；③体外细胞增殖实验提示HSA-PEI-pcDNA-Apoptin组吸光度值明显低于 HSA-PEI-pcDNA 组及空白对照组(P <0.05)；④裸鼠乳腺癌模型HSA-PEI-pcDNA-Apoptin组肿瘤体积小于HSA-PEI-pcDNA组及空白对照组(P<0.05)；⑤结果表明， HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物有明显的抑制肿瘤作用。 -
凋亡素与热休克蛋白70启动子区热休克元件特异结合诱导HepG2细胞凋亡
目的 探讨凋亡素下调HepG2细胞热休克蛋白70 (HSP70)的分子机制.分析凋亡素与HSP70启动子区热休克元件(HSE)的相互结合作用.方法 应用凝胶电泳迁移率分析(EMSA)法检测凋亡素与HSE的结合；荧光素酶报告基因实验进一步分析凋亡素在细胞内与HSE的结合能力.结果 EMSA结果表明凋亡素在体外和细胞水平可以直接与HSP70启动子区的HSE结合,凋亡素浓度越高,与HSE结合能力越强；Luciferase报告基因结果显示凋亡素对HSE具有专一的结合能力,揭示在与HSE结合上,凋亡素与HSF1间存在竞争关系.结论 凋亡素与HSP70启动子区HSE序列结合,抑制HSP70转录的起始,显著下调HSP70的表达,解除HSP70对肿瘤细胞的保护作用,诱导肿瘤细胞的凋亡.
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TAT-Apoptin融合蛋白分泌表达载体的构建及其活性检测
目的 构建具有自主跨膜能力的Apoptin融合蛋白表达载体,使其分泌表达,避开包涵体复性,简化制备工艺.方法 人工合成反式激活蛋白(TAT)序列,与Apoptin序列融合,连接到pET22b+载体上,构建原核分泌表达载体pET22b+-TAT-Apoptin,IPTG诱导目的蛋白分泌表达到大肠杆菌周质空间,提取蛋白行SDS-PAGE分析,MTT法检测分泌表达的融合蛋白对胃癌823细胞的抑制作用.结果 重组TAT-Apoptin蛋白可分泌至大肠杆菌周质空间中,以可溶状态存在,对胃癌823细胞的大抑制率为83.95％.结论 成功构建重组TAT-Apoptin蛋白表达载体,分泌表达的可溶性融合蛋白具有生物活性.
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携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达
目的 利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达.方法 扩增目的基因VP3 cDNA,与EcoRⅤ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切线性化pShuttle-VP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,并经PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及VP3蛋白表达水平.结果 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功,PCR反应扩增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中,且其序列与GenBank中VP3 CDNA序列完全一致.成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒,滴度为1.738×1012 opu/ml,重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达.结论 用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并可在人结肠癌细胞中高效表达.
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肝癌Hep3B细胞蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子表达水平对凋亡素诱导凋亡的作用
目的:探讨肝癌HepB3细胞中蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A)的表达水平对凋亡素诱导凋亡效率的影响,为研究凋亡素特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供依据.方法:定制合成CIP2A特异性siRNA,构建真核表达质粒pcDNA3-HA-Apoptin.以pcDNA3-HA-Apoptin和CIP2A siRNA共转染HepB3细胞作为实验组,转染pcDNA3-HA-Apoptin和CIP2A scrambled siRNA的HepB3细胞作为阳性对照组,转染pcDNA3和CIP2A siRNA的HepB3细胞作为阴性对照组,转染pcDNA3和CIP2A scrambled siRNA的HepB3细胞作为空白对照组.Western blotting法检测各组HepB3细胞中CIP2A和HA-Apoptin表达水平;流式细胞术检测各组HepB3细胞凋亡率;免疫荧光法检测各组HA-Apoptin在HepB3细胞核、质分布.结果:Western blotting法检测,与阴性对照组比较,实验组HepB3细胞内中CIP2A表达水平显著下降(P＜0.001);Western blotting和流式细胞术检测,与阳性对照组比较,实验组HepB3细胞凋亡率显著降低(P＜0.01);免疫荧光法检测,与阳性对照组比较,实验组HA-Apoptin在HepB3细胞质内的分布增多.结论:肝癌HepB3细胞中CIP2A表达水平下调降低了凋亡素诱导的凋亡.
关键词： 肝肿瘤 蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子 凋亡素 细胞凋亡
