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R11介导的DAB2IP功能片段P10对宫颈癌细胞系Siha放疗增敏效应的研究
目的 本研究旨在探索R11-P10靶向穿膜肽在肿瘤细胞中的摄取及生物学作用. 方法 构建、纯化细胞穿膜肽,利用流式细胞仪检测细胞内荧光摄取率;通过测绘生长曲线,观察R11-P10是否对宫颈癌细胞系Siha起生长抑制作用及流式细胞术检测转染前后Siha的细胞周期分布变化;用Western-blot方法测定Siha转染R11-P10或/和UV照射前后p-AKT蛋白表达量的变化. 结果 流式细胞仪检测结果显示R11可携带多肽片段P10进入Siha,且R11-P10能增加Siha细胞的G2期阻滞.而细胞克隆形成实验发现R11-P10可增强Siha的放疗敏感性,Western blot结果表明R11-P10处理后的Siha细胞株接受放疗后,p-Akt含量显著下降. 结论 本课题为宫颈癌治疗提供了一种新型高效的多肽靶向药物,对宫颈癌放疗耐受和肿瘤复发的治疗策略具有重要意义.
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Pep-1-vMIP-Ⅱ对小鼠抗HIV-Ⅰ基因表达的作用
目的 探讨融合蛋白Pep-1-vMIP-Ⅱ在影响宿主ARGs基因表达抵抗HIV-Ⅰ感染中的作用.方法 小鼠背部涂抹Pep-1-vMIP-Ⅱ2 h后,用免疫组织化学方法测定不同组织器官中vMIP-Ⅱ的穿膜情况.用实时定量PCR,检测24h后不同组织器官中ARGs mRNA表达水平;用Graphpad Prism 5软件分析实验数据.结果 皮肤涂抹Pep-1-vMIP-Ⅱ组2h后vMIP-Ⅱ在肾脏分布明显增加(P＜0.05);涂抹Pep1-vMIP-Ⅱ 24 h后,白细胞、肾、心、肝和肺中CCL5的mRNA表达水平有明显差异(P＜0.05),脑组织中CCL5的表达未见明显增加;MX1、MX2在多种组织中都表达上调(P＜0.05).结论 Pep-1-vMIP-Ⅱ可以穿透小鼠皮肤进入肾脏组织,主要通过激活CCL5基因表达发挥调控作用.
关键词： 细胞穿膜肽 病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ 人疱疹病毒8 -
RGD和细胞穿膜肽共修饰脂质体的构建及其体外功能评价
目的 制备RGD和TAT共修饰载紫杉醇(PTX)脂质体(RGD/TAT-LP-PTX),研究其理化性质和体外抗肿瘤作用.方法 薄膜分散法制备RGD/TAT-LP-PTX,研究其理化性质;检测肝癌HepG2细胞对RGD/TAT-LP的摄取效率以及脂质体的摄取机制.共聚焦实验研究肿瘤细胞对脂质体的摄取.MTT检测RGD/TAT-LP-PTX对HepG2细胞的增殖抑制作用.结果 RGD/TAT-LP-PTX的粒径134.5 ±8.4 nm,电位为22.35±2.55 mV,紫杉醇的包封率84.6％.RGD/TAT-LP在4h摄取效率是2h的1.65倍(P＜0.05);HepG2细胞在4h对RGD/TAT-LP的摄取效率分别是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P＜ 0.01);RGD/TAT-LP-PTX在24 h HepG2细胞的存活率是48 h的1.75倍(P＜0.05);给药48 h后,TAT-LP-PTX、RGD-LP-PTX和LP-PTX的细胞存活率分别是RGD/TAT-LP-PTX组的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P＜0.01).结论 RGD和TAT共修饰紫杉醇脂质体是一种潜在高效的肿瘤靶向给药系统.
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CPPs-BDI-1-载丝裂霉素白蛋白纳米微球的构建及其体外内化人膀胱癌细胞潜能的可行性研究
目的 分析CPPs-BDI-1-载丝裂霉素(MMC)白蛋白纳米微球三联体的构建及其体外对人膀胱癌细胞转染的潜在能力,为后续实验构建靶向膀胱癌的新型药物传送系统及治疗奠定基础.方法 于2011年2月至2013年10月,制备穿膜肽增强型绿色荧光蛋白TAT-EGFP、抗人膀胱癌单克隆抗体(BDI-1)、载丝裂霉素微球(MMC-NS),采用异型双功能连接剂SPDP耦联构建纳米微球三联体CPPs-BDI-1-MMC-NS.应用构建的纳米微球三联体体外转染人膀胱癌细胞,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测白蛋白纳米微球三联体对人膀胱癌细胞的内化潜能及其治疗效果.结果 应用异型双功能连接剂SPDP成功耦联穿膜肽、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体CPPs-BDI-1-MMC-NS,纳米微球直径300 nm,可携带化疗药物.实验证实微球三联体具有很强的肿瘤细胞靶向性和穿膜活性,可以高效转染人膀胱癌细胞.结论 制备的白蛋白纳米微球三联体可以作为一种新型靶向膀胱癌的药物传送系统;发现肿瘤细胞膜表面微绒毛与载MMC白蛋白纳米微球三联体内化细胞内部相关,且微球内化入肿瘤细胞后微绒毛消失.
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RGD与细胞穿膜肽共修饰miRNA脂质体的构建及抗肿瘤研究
目的 制备RGD和细胞穿膜肽TAT共修饰载microRNA-34a脂质体(RGD/TAT-miLPs-34a),对其理化性质进行表征,研究脂质体与人骨肉瘤MG63细胞的亲和力和增殖抑制作用.方法 采用薄膜分散法制备RGD/TAT-miLPs-34a;定量细胞摄取实验研究MG63细胞对RGD/TAT-miLPs-34a的摄取效率以及对脂质体摄取的影响因素.定性共聚焦实验观察肿瘤细胞对脂质体的摄取.MTT实验研究RGD/TAT-miLPs-34a对MG63细胞的细胞毒性;构建骨肉瘤异位瘤模型,研究不同脂质体对肿瘤的生长抑制率.结果 MG63细胞在与脂质体共同孵育4h后,RGD/TAT-miLPs-34a组摄取效率为(185.3±17.5)％,TAT-miLPs-34a组为(67.5±8.6)％,RGD-miLPs-34a组为(82.7±9.5)％,miLPs-34a组为(40.9±7.8)％,差异有统计学意义,H=27.93,P＜0.001.RGD/TAT-miLPs-34a 4 h摄取效率是2h摄取效率(101.3±12.4)％的1.83倍,差异有统计学意义,z=5.58,P=0.001.骨肉瘤MG63细胞给药48 h后,RGD/TAT-miLPs-34a组MG63细胞存活率为(18.5±5.3)％,TAT-miLPs-34a组为(36.1±5.2)％、RGD-miIPs-34a组为(44.8±6.7)％,miLPs-34a组为(67.7±8.9)％,生理盐水组为(98.7±3.6)％,差异有统计学意义,H=19.271,P＜0.001.荷瘤裸鼠治疗实验miLPs-34a组对肿瘤生长的抑制率为(19.4±3.2)％,RGD-miLPs-34a组为(39.6±4.8)％,TAT-miLPs-34a组为(42.6±6.5)％,RGD/TAT-miLPs-34a组为(73.7±7.1)％,生理盐水组为0,差异有统计学意义,F=145.237,P＜0.001.结论 细胞穿膜肽与RGD共修饰载miRNA脂质体能够有效识别并穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞,是一种潜在高效的骨肉瘤靶向给药系统.
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CADY细胞穿膜肽作为siRNA递送载体的研究进展
如何将小干扰RNA(siRNA)分子高效安全地递送至靶细胞内,使其有效沉默靶基因,是制约RNA干扰技术临床应用的瓶颈.近年来,基于细胞穿膜肽的siRNA递送技术发展迅速,其中,次级两亲性细胞穿膜肽CADY细胞毒性低、无免疫原性且能与siRNA非共价结合形成稳定的纳米复合物,在多种细胞系中具有良好的递送效率,已成为极具应用前景的siRNA递送载体.本文主要对CADY的研究设计思路、结构特点、空间构型、穿膜机制、结构优化和应用方面进行综述.
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细胞穿膜肽在药物递送系统中的研究进展
细胞膜是蛋白质、核酸及药物分子进入细胞的主要生物学屏障.近年来的研究发现细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)能够有效地将小分子药物、蛋白质、肽类、核酸片段以及纳米载体(如脂质体、聚合物胶束、无机纳米粒等)转运穿过细胞膜.本文就细胞穿膜肽的分类及其在介导小分子药物、蛋白质及多肽、核酸和纳米载体特别是“智能”纳米载体等的转运入胞作用进行了讨论.
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可活化细胞穿膜肽在肿瘤治疗领域的应用
细胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多种细胞膜功能的小分子多肽,能携带生物活性大分子物质进入细胞.由于CPP缺乏组织选择性和靶向性,限制了其在肿瘤治疗领域的应用.可活化细胞穿膜肽(ACPP)的出现给CPP的应用带来了曙光.本文重点介绍基于肿瘤微环境与正常组织之间的差异以及利用外源性物理刺激设计而成的ACPP在抗肿瘤药物靶向递送方面的应用.
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细胞穿膜肽作为药物载体的研究进展
生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要的作用,但由于细胞膜的天然屏障作用,只有分子质量小于600 Da的分子才能穿透细胞膜进入细胞内.这使得一些有治疗价值但无细胞膜穿透性的分子在细胞生物学、药学等领域的应用受到极大的限制.近年来发现的一些具有细胞穿透功能的短肽(少于30个氨基酸)即细胞穿膜肽(CPPs),能够有效地将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入多种哺乳动物细胞.其转导效率高且不会造成细胞损伤.CPPs的发现为生物大分子在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价以及细胞免疫学等研究领域等均具有良好的应用前景.本文就CPPs的种类特点、内化机制、应用及其存在的问题进行讨论和评述.
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抗肿瘤活性的新型高效细胞穿膜肽[Cys-CPT2,9]penetratin的设计及活性评价
本文将半胱氨酸-喜树碱(Cys-camptothecin,Cys-CPT)引进penetratin第2、9位,合成新型穿膜肽类似物[Cys-CPT2,9] penetratin,旨在探索一条具有强穿膜活性且具有抗肿瘤活性的新型细胞穿膜肽.通过激光共聚焦实验和流式细胞术观察[Cys-CPT2,9] penetratin在HeLa细胞中荧光摄取情况,使用不同内吞抑制剂研究[Cys-CPT2,9] penetratin的细胞摄取机制,后通过MTT实验测试[Cys-CPT2,9] penetratin抗肿瘤活性.在激光共聚焦及流式细胞术实验中显示[Cys-CPT2,9] penetratin的穿膜活性显著增强,它的胞内荧光强度比penetratin明显提高5倍.而对于[Cys-CPT2,9] penetratin的细胞摄取机制,它主要通过网格蛋白和巨胞饮内吞途径进入细胞内.[Cys-CPT2,9] penetratin对HeLa细胞具有抗肿瘤活性,并强于抗肿瘤药物喜树碱.结果说明,[Cys-CPT2,9]penetratin是一个新的高膜转导活性的细胞穿膜肽,同时对HeLa细胞具有抗肿瘤活性.
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pH敏感性的TAT肽修饰胶束的制备及其体外评价
本文采用具有pH敏感性的硬脂酰磺胺甲氧嘧啶、mPEG2000-DOPE和TAT肽(transactivator oftranscription peptide)修饰的聚乙二醇化磷脂,以薄膜分散法制备了载阿霉素的聚合物胶束.pH敏感胶束在pH7.4的粒径约为20 nm,阿霉素的包封率为(99.1 4±2.1)%.流式细胞术显示,pH 7.4和pH 6.8时TAT修饰的胶束均可迅速被摄取;而pH敏感胶束在pH 7.4时进入细胞较少,pH 6.8时进入细胞增多,孵育1 h后摄取量接近TAT修饰胶束.激光共聚焦显示pH敏感胶柬在pH 6.8时肿瘤细胞摄取量显著大于pH 7.4.结果说明,该胶束具有pH敏感性,pH 7.4时屏蔽TAT肽,避免其无选择性的透膜进入细胞,而在pH 6.8时暴露出TAT肽,发挥其进入细胞的能力,介导载药胶束进入肿瘤细胞,实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的.此pH敏感胶束是一种有前景的肿瘤靶向给药系统.
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穿膜肽促进三氧化二砷蛋白微球进入膀胱肿瘤EJ细胞的实验研究
目的:研究穿膜肽(CPPs)对载三氧化二砷蛋白微球进入细胞内的促进作用.方法:通过交联固化的方法制备三氧化二砷蛋白微球,Ⅳ-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸脂(SPDP)交联的方法制备穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白-三氧化二砷蛋白微球偶联物(As2O3-NS-CPPs-EGFP).采用还原电泳、荧光显微镜和扫描电镜观察的方法鉴定As2O3-NS-CPPs-EGFP偶联物,激光共聚焦显微镜和透射电镜观察穿膜肽对蛋白微球进入细胞的促进作用,细胞内砷浓度测定明确药物细胞内传送效率.结果:CPPs-EGFP与三氧化二砷蛋白微球之间通过共价健连接,与穿膜肽偶联的三氧化二砷蛋白微球进入细胞内速度明显要快于单纯的三氧化二砷蛋白微球,用As2O3-NS-CPPs-EGFP处理组膀胱肿瘤细胞内砷浓度明显高于As2O3-NS-EGFP处理组.结论:CPPs-EGFP具有促进As2O3-NS进入膀胱肿瘤细胞内的作用.
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细胞穿膜肽在癌症治疗中的应用
细胞膜有选择渗透性,能阻止大多数外来因子进入细胞.然而许多治疗因子必须穿过细胞膜才能进入细胞内起作用.细胞穿膜肽是一组简短的阳离子序列,它具有很强的穿膜能力.自从1988年发现细胞穿膜肽后,细胞穿膜肽被用于携带各种物质,如小分子、核酸、抗体、纳米粒等进入细胞膜.本文重点介绍了近几年来关于细胞穿膜肽穿膜机制的研究进展,以及细胞穿膜肽作为运载体携带抗癌药物靶向进入肿瘤细胞,从而实现对肿瘤细胞的靶向性,同时可克服肿瘤的多药抗药性等研究进展.
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多肽类药物药代动力学特点及其代谢机制研究进展
多肽类药物半衰期短,表观分布容积小,毒副作用低,已被广泛用于癌症和代谢性疾病的防治.了解其药代动力学特征和代谢机制有利于指导其合成与优化.肽类药物常通过静脉注射、腹腔注射和皮下注射等途径给药.药物通过静脉注射可直接进入循环系统,生物利用度接近100％,是一种理想的给药方式.多肽类一般膜渗透性较低,其跨膜转运受分子大小、极性以及构象等因素的限制,药物的血浆蛋白结合与药物潜在的免疫原性都可影响其药代动力学特征,对药物的定量分析造成干扰.多肽类药物的主要消除机制为代谢酶降解和肾小球过滤消除,还存在基于内体-溶酶体的内吞消除等机制.本文结合作者的研究工作,综述了近年来其药动学的研究进展和难点,为多肽药物的相关研究提供理论和技术基础.
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叶酸及细胞穿膜肽修饰的纳米脂质载体穿透体外肿瘤球模型研究
纳米递药系统的表面修饰作用会对载体的穿透能力产生影响.本研究通过使用叶酸配体和细胞穿膜肽分别修饰的纳米脂质载体,在堆积法建立的肿瘤球模型上实时分析细胞靶向和细胞穿透作用对于纳米脂质载体的肿瘤穿透能力的影响.研究结果表明细胞穿透肽修饰的纳米脂质载体不论是从穿透深度还是强度上,在穿透早期都具备更好的穿透肿瘤球能力.
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细胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ促进血管增生研究
目的 构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其时血管增生相关基因表达的影响.方法 将化学合成的细胞穿膜肽PEP1和vMIP-Ⅱ基因克隆到原核表达载体pET15b,构建pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒.表达纯化后,Western-blot鉴定蛋白,荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白的穿膜功能.Real time PCR检测该蛋白作用对HMEC-1细胞内血管增生相关基因表达的改变.结果 DNA测序和酶切结果鉴定了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体构建正确,Western blot鉴定纯化的融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ与所预测相对分子质量相符.激光共聚焦显微镜检测到该蛋白能够进入细胞,在HMEC-1细胞内上调了促血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达.结论 成功构建了pET156-PEP1-vMIP-Ⅱ载体,表达纯化的PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白具有穿透细胞膜的功能,且能显著上调促进血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达.
关键词： 细胞穿膜肽 病毒趋化因子炎症蛋白 血管增生 基因 -
细胞穿膜肽VP22增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布
目的 制备表达细胞穿膜肽融合蛋白PTEN-VP22的真核表达质粒,验证细胞穿膜肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布.方法 构建重组真核表达质粒pcDNA3-PTEN与pcDNA3-PTEN-VP22,转染BT549细胞,Western blot与免疫荧光检测PTEN蛋白与PTEN-VP22融合蛋白的表达与分布.结果 PTEN蛋白与PTEN-VP22融合蛋白在BT549细胞中成功表达;PTEN-VP22在转染细胞中的表达与分布较之PTEN明显增多,且在细胞间的分布呈现典型的VP22分布特点,并主要分布于细胞核.结论 细胞穿膜肽VP22增强了抑癌蛋白PTEN在BT549细胞的表达和分布.
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穿膜肽凋亡素融合蛋白诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究
目的 探讨新型细胞穿膜肽hPP10和凋亡素Apoptin融合蛋白介导小鼠黑色素瘤细胞B16凋亡的效应.方法 构建pET15b-hPP10-Apoptin、pET15b-Apoptin原核表达质粒,经IPTG诱导和NI-NTA树脂纯化后得到融合蛋白;运用TUNEL法体外检测hPP10-Apoptin诱导B16细胞的凋亡效应;制备荷瘤小鼠模型,并在体内检测hPP10-Apoptin融合蛋白的抗肿瘤能力.结果 融合蛋白hPP10-Apoptin经Western blot鉴定正确,且此融合蛋白能在体内外有效诱导B16黑色素瘤细胞凋亡.结论 新型细胞穿膜肽hPP10可有效携带Apoptin穿透细胞膜并发挥抗肿瘤作用.
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细胞穿膜肽的研究进展
目的 综述细胞穿膜肽的研究进展.方法 以近年来研究文献为基础,对细胞穿膜肽的结构特点、分类、内化机制、应用以及新的研究方向等进行综述.结果 细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类由不多于30个氨基酸组成的小分子多肽,根据其氨基酸组成,可分为阳离子细胞穿膜肽和两亲性细胞穿膜肽.体内外研究表明,细胞穿膜肽能够介导多种载体的穿膜作用,无刺激性,并且在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用.结论 细胞穿膜肽的作用机制仍需进行深入探讨,但其作为一种新型药物递送工具,具有广泛的应用前景.
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细胞穿膜肽作为皮肤渗透促进剂的研究进展
目的 综述细胞穿膜肽作为皮肤渗透促进剂的研究进展.方法 参考近年来国内外相关文献,对细胞穿膜肽的起源、分类以及在经皮给药系统中的应用等进行综述.结果 细胞穿膜肽是具有细胞膜穿透能力的小肽,能有效地促进核酸类、肽类、蛋白质类等生物大分子药物经皮吸收.结论 细胞穿膜肽作为一种新型的透皮给药渗透促进剂有巨大潜在的应用价值,但其促透机制需要更深入的研究.
