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粗毛豚草素壳聚糖微球的制备及体外抗肿瘤作用评价
为将粗毛豚草素(hispidulin,HPDL)通过静脉注射输送至病变部位,该研究制备了粗毛豚草素壳聚糖微球并评价其体外抗肿瘤作用以及对A549细胞肿瘤球的生长抑制作用.以壳聚糖为药物载体,采用乳化-交联法制备粗毛豚草素壳聚糖微球,高效液相色谱测定粗毛豚草素的含量;运用扫描电镜观察目标微球形态;透析法进行目标微球的体外释放特性研究;采用磺酰罗丹明B蛋白(SRB)法考察载药微球对A549细胞的生长抑制作用并采用流式细胞仪考察载药微球对A549细胞的早期凋亡作用;培养肺腺癌A549细胞肿瘤球,加入载药微球,分别于给药后0,1,3,7d在倒置显微镜下观察肿瘤球的形态、体积变化.结果显示制备的载药微球中粗毛豚草素的包封率为(75.32±0.52)％,载药量为(7.76±0.67)％;目标微球形态圆整,表面光滑.制备得到的载药微球对A549细胞的增殖具有较强的抑制作用;流式细胞仪检测结果表明,给药后将细胞培养至24h时,肺腺癌A549细胞早期凋亡率为(37.0±0.75)％,经载药微球干预后肿瘤球体积明显受到抑制,干预7d后肿瘤球体积缩小(50.09±11.06)％,表面细胞裂解.该制备载药微球的方法简单易行,微球形态圆整,包封率高,能显著抑制肺腺癌A549细胞增殖并诱导细胞凋亡,同时可引起肺腺癌A549细胞肿瘤球的裂解死亡.
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叶酸及细胞穿膜肽修饰的纳米脂质载体穿透体外肿瘤球模型研究
纳米递药系统的表面修饰作用会对载体的穿透能力产生影响.本研究通过使用叶酸配体和细胞穿膜肽分别修饰的纳米脂质载体,在堆积法建立的肿瘤球模型上实时分析细胞靶向和细胞穿透作用对于纳米脂质载体的肿瘤穿透能力的影响.研究结果表明细胞穿透肽修饰的纳米脂质载体不论是从穿透深度还是强度上,在穿透早期都具备更好的穿透肿瘤球能力.
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TR短肽修饰的DSPE-PEG胶束对CD133高表达胶质瘤肿瘤干细胞体外靶向性评价
肿瘤干细胞已经成为药物递送的一个新靶点.肿瘤干细胞表面表达特异性标志物,其中CD133在胶质瘤肿瘤干细胞中高表达.因此,我们通过将特异性结合CD133的TR短肽修饰到药物递送系统上,来达到靶向递送药物的胶质瘤干细胞的目的.首先,我们将TR短肽与DSPE-PEG连接,构建包载香豆素-6的主被动DSPE-PEG胶束.之后,我们通过荧光激发免疫细胞分选法和肿瘤球培养法分离胶质瘤肿瘤干细胞.通过共聚焦显微镜和流式细胞仪检测发现,肿瘤干细胞对TR修饰的胶束摄取增多,证明TR修饰胶束具有体外靶向性.由此表明,TR修饰胶束有可能提供了针对CD133+肿瘤干细胞的新的治疗策略.
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肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞的生物学功能研究
目的:探讨肺癌A549细胞株中具有肿瘤干细胞特性的ALDH1+细胞的生物学功能特性.方法:运用流式细胞仪分选肺癌A549细胞株中ALDH1+细胞,并通过肿瘤球培养、MTT实验、平板克隆、Transwell小室迁移实验、裸鼠体内成瘤实验来验证ALDH1+细胞的自我更新、增殖克隆、迁移及致瘤能力.结果:ALDH1+ A549细胞的肿瘤球形成能力、增殖克隆、迁移和体内成瘤能力明显高于ALDH1- A549细胞和未经分选的A549细胞.结论:A549细胞株中ALDH1+ A549细胞具有自我更新、增殖、迁移和高致瘤能力的肿瘤干细胞特性,ALDH1可作为分选肺癌肿瘤干细胞的标志物.
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干细胞转录因子Oct4在食管鳞癌中表达的研究
目的 研究干细胞转录因子Oct4在人食管鳞癌中的表达,探讨其在食管鳞癌中发病机制中的作用.方法 通过免疫组化及反转录PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测于细胞转录因子Oct4、Sox2和Nanog在食管鳞癌、良性食管粘膜组织芯片及食管癌肿瘤球中的表达,通过于细胞培养基培养食管癌肿瘤球,检测Oct4在肿瘤球及肿瘤球分化后的细胞表达.结果 Oct4蛋白在绝大多数的食管鳞癌中均表达(45/55,81.8％),但不表达在良性食管粘膜中(0/26,0.0％).Oct4和Sox2也检测到(分别是42/55,76.4％; 39/55,70.9％).15份新鲜食管癌标本通过干细胞培养基培养均形成了肿瘤球,检测后均表达Oct4蛋白,对比肿瘤球分化后细胞,肿瘤球表达更高水平的Oct4、Nanog和Sox2 mRNA,也表现出更高的增殖潜能.结论 Oct4在食管癌中的离表达提示Oct4在食管癌的发病机制中扮演着重要角色,是食管鳞癌治疗的一个潜在靶点;同时是一个分辨食管鳞癌及良性食管粘膜的方法.
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肺癌细胞株A549的常见肿瘤干细胞抗原分析和细胞分选比较
背景:多项研究表明癌症有可能是起源于肿瘤组织内一个细胞亚群即肿瘤干细胞,近期的研究发现肺癌内也存在肿瘤干细胞,但肺癌内存在的肿瘤干细胞的表型目前仍未取得一致.目的:对人类非小细胞肺癌细胞株A549通过目前常见的肿瘤干细胞表面抗原进行全面系统分析.方法:A549肺癌细胞株在常规高糖培养环境下,培养1周后进行表面抗原的检测.使用流式细胞术分析A549细胞CD133,CD44,CD24以及ABC运转蛋白家族G2的表达情况,并且通过流式分选的方法分离出CD44+/CD24+和CD44+/CD24-两类亚群细胞,在低黏附、无血清并添加生长因子的环境下观察肿瘤干细胞肿瘤球形成的能力.结果与结论:①细胞表型变化:A549细胞中度表达肿瘤干细胞常见的抗原CD44(64.23％)和CD24(58.62％),而CD133和ABC运转蛋白家族G2的表达率很低,均约为0.9％,其中CD133/CD44双阳性的细胞数比例极低.表型为CD44+/CD24+和CD44+/CD24-的细胞群比例分别为54.64％和23.38％.两类亚群细胞在碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子存在的条件下,无血清培养均可形成肿瘤干细胞肿瘤球;②肿瘤球形成效率:CD44+/CD24+和CD44+/CD24-的细胞群其肿瘤干细胞肿瘤球形成效率与A549细胞相比差异无显著性意义;③结果说明:CD44和CD24也许并非肺癌肿瘤干细胞的特异性标志,对于肺癌内肿瘤干细胞的表型鉴别还需要更多的研究.
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胃癌干细胞的分离鉴定以及干细胞特性研究
背景：肿瘤干细胞（ CSCs）已成为当前肿瘤研究的热点之一，开展相关研究的首要问题是CSCs的分离和鉴定，悬浮培养法是分离CSCs的重要方法。目的：分离、鉴定胃癌干细胞（ GCSCs ）并评价其干细胞特性。方法：人胃癌细胞株MKN45、MGC803、SGC7901以含表皮生长因子（ EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF）的无血清培养基悬浮培养。对培养得到的第三代肿瘤球，以集落形成实验检测其克隆形成能力，免疫荧光法检测GCSCs标记物，细胞划痕实验和Transwell小室细胞侵袭实验检测其迁移、侵袭能力，CCK-8实验检测其对顺铂的耐药性。结果：培养得到的肿瘤球高表达干细胞标记物CD44、CD54，低表达胃壁细胞标记物H+/K+-ATPase，克隆形成能力、划痕愈合速度和Transwell小室穿膜细胞数明显大于或多于普通胃癌细胞，差异有统计学意义（ P<0.05）。顺铂对肿瘤球的50%抑制浓度明显高于普通胃癌细胞。结论：应用无血清培养基悬浮培养法能成功获得GCSCs富集的肿瘤球；肿瘤球具有较强的自我更新、增殖、迁移、侵袭能力和多向分化潜能，对化疗药物更易产生耐药性。
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悬浮培养在肿瘤干细胞研究中的应用及局限性
肿瘤干细胞被认为是肿瘤起源、生长和转移的关键因素,已成为当下肿瘤研究的热点之一.由于大多数肿瘤干细胞缺乏特异性的标志物,且组织定位和形态特征不明确,因此无法直接从肿瘤细胞中分离,当前常利用肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞功能上的差异区分这2类细胞.悬浮培养法是常用的组织干细胞及肿瘤干细胞的体外研究方法,它能够直观地在单细胞层面上反映细胞的自我更新及增殖能力,因此被广泛用于肿瘤干细胞的鉴定、富集和纯化.然而,悬浮培养获得的细胞与体内真正的肿瘤干细胞存在本质的差别,获得的肿瘤球并不一定具克隆性,且并不是所有具备干细胞性质的细胞都能在悬浮条件下存活.因此,当使用悬浮培养研究肿瘤干细胞时,必须意识到它的局限性,本文旨在对这一问题的研究作一综述.
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三维肿瘤球的培养以及在肿瘤体外研究中的应用
与单层平面培养的肿瘤细胞相比,三维肿瘤球可以更好地模拟肿瘤细胞之间以及细胞外基质间信号转导的微环境,近年来被广泛用于肿瘤细胞形态学的研究、肿瘤干细胞的富集以及抗癌药物高通量筛选等方面,是肿瘤研究领域好的体外模型之一.综述三维肿瘤球的构建以及在肿瘤体外研究中的应用.
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胶质母细胞瘤干细胞成球培养与患者预后的相关性研究
目的 探索胶质瘤中的干细胞的成球能力与治疗效果的关系.方法 选取41例外科手术切除的胶质瘤样本,术后均接受放疗及TMZ化疗.将胶质瘤组织进行肿瘤干细胞富集成球培养,并分析肿瘤细胞成球率及肿瘤球对于1～60 Gy剂量放疗和3.9μmol/L～1 mmol/L TMZ化疗的敏感性与患者生存率的相关性.结果 胶质瘤细胞成球能力与患者较差的总生存期或无进展生存期(progression-free survival,PFS)具有相关性.胶质瘤细胞成球后对于放化疗有较强的抗性,放射半致死计量>12 Gy的肿瘤球来源的患者具有较短的PFS,生存期也较短.肿瘤球对于TMZ化疗的敏感性和患者的生存率有直接联系,TMZ的半数抑制剂量<50μmol/L的肿瘤球来源的患者具有更长的OS和PFS.结论 肿瘤球放疗敏感性检测可以指导临床对患者治疗的策略选择,以期达到更好的治疗效果.
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干细胞转录因子Nanog在子宫内膜腺癌中的表达
目的:研究干细胞转录因子Nanog在人子宫内膜癌中的表达.方法:通过免疫组化及反转录PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测干细胞转录因子Nanog,Sox2和Oct4在子宫内膜癌、良性子宫内膜组织芯片及内膜癌肿瘤球中的表达,通过干细胞培养基培养内膜癌肿瘤球,肿瘤球移植入15只免疫缺陷小鼠,观察继发肿瘤形成,检测Nanog在肿瘤球及肿瘤球分化后细胞表达;同时应用流式细胞术、MTT[3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]法分别检测肿瘤球及其分化后细胞的凋亡率及增殖能力.结果:Nanog蛋白在绝大多数的子宫内膜癌中均表达(45/55,81.8％),但不表达在良性内膜中(0/26,0.0％).Oct4和Sox2也被检测到表达在内膜癌中(分别是42/55,76.4％;39/55,70.9％).15例新鲜内膜癌标本通过干细胞培养基培养均形成了肿瘤球,检测后均表达Nanog蛋白,对比肿瘤球分化后细胞,肿瘤球表达更高水平的Nanog、Oct4和Sox2 mRNA,也表现出更高增殖潜能.15只免疫缺陷小鼠注射肿瘤球细胞后均形成了移植瘤,但分化后细胞注射后只有3只小鼠形成移植瘤.移植瘤同样表达Nanog蛋白,同时表达Nanog、Oct4和Sox2的mRNA,与分化后细胞相比,同样表现出更高的增殖潜能及较低的凋亡率.结论:Nanog在子宫内膜癌中的高表达提示Nanog在子宫内膜癌的发病机制中扮演着重要角色,是子宫内膜腺癌治疗的一个潜在靶点;同时,检测Nanog蛋白也是一个分辨子宫内膜腺癌及良性子宫内膜的方法;同时Nanog在移植瘤中的表达提示其可能参与肿瘤转移.
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紫花牡荆素对卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成的影响
目的:研究紫花牡荆素(casticin,CAS)是否抑制卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力.方法:肿瘤球形成法检测不同浓度CAS(1.0、3.0、10.0 μmol/L)对OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力的影响.Western Blot分析探讨CAS影响OVCAR-3细胞系肿瘤球形成机制是否涉及其下调干细胞标志物CD44蛋白表达.结果:CAS以浓度依赖方式抑制OVCAR-3细胞系肿瘤球形成能力.与亲本细胞相比,OVCAR-3细胞系球形成细胞高表达CD44蛋白.CAS显著下调OVCAR-3细胞系球形成细胞CD44蛋白表达.结论:CAS抑制卵巢癌OVCAR-3细胞系肿瘤球形成与其下调干细胞标志物CD44蛋白表达相关.
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前胃泌素在人胃癌BGC-823细胞的悬浮肿瘤球中的表达
目的 研究人胃癌BGC-823肿瘤细胞系中是否存在悬浮生长的肿瘤球,检测前胃泌素(progastrin,Pro-GRP)在肿瘤球中的表达.方法 取贴壁生长的BGC-823细胞,用有限稀释法和无血清培养法培养,并利用软琼脂克隆形成实验证实BGC-823中存在悬浮生长的具有干细胞特性的肿瘤球,流式细胞仪(FCM)检测该肿瘤球中ABCG2、CD44、CD166的表达.ELISA、细胞免疫荧光、FCM方法比较血清Pro-GRP分别在肿瘤球和贴壁细胞中的表达差异.结果 有限稀释法和无血清培养法均在BGC-823细胞系中培养出了悬浮生长的肿瘤球;克隆形成能力显示:肿瘤球为(37.63±5 99),贴壁细胞为(10.75±3.37),二者间有统计学差异(P<0.01);FCM显示肿瘤球ABCG2的表达率(57.17±3.49)明显高于贴壁细胞(8.67±0.77)(P<0.01);血清Pro-GRP在肿瘤球中的表达(73.37±9.42)明显高于贴壁细胞(5.11±1 03)(P<0.01).结论 人胃癌BGC-823 细胞系中存在悬浮生长的肿瘤球,Pro-GRP的表达与肿瘤球有关.
关键词： 胃癌细胞系BGC-823 肿瘤球 前胃泌素 FCM -
人结肠癌CCL187细胞肿瘤球细胞干细胞特性研究
目的:研究体外培养条件下人结肠癌CCL187细胞系肿瘤球细胞的干细胞特性.方法:用无血清培养液和低吸附6孔培养板培养CCL187细胞,显微镜观察肿瘤球形成,荧光染料Hoechst33342染色观察干样细胞,用24孔培养板接种绘制CCL187细胞和肿瘤球细胞的生长曲线,顺铂和依托泊苷处理检测两种细胞抵抗化疗的能力.结果:CCL187细胞在无血清培养条件下可形成肿瘤球,肿瘤球细胞中存在浅染的干样细胞.两种细胞的生长曲线显示肿瘤球细胞的自我繁殖能力大于CCL187细胞.化疗药物处理显示肿瘤球细胞比一般肿瘤细胞具有更强的化疗抵抗性.结论:CCL187细胞的肿瘤球细胞具有肿瘤干细胞特性.
