细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导

目的 研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500 μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察.结果 2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光.结论 细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据.

融合蛋白TAT-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

目的 观察融合蛋白TAT-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用.方法 含80 nmol/L浓度TAT-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60 min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予TAT-NEP1-40、TAT-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst 33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察TAT-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用.结果 (1)TAT-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,TAT-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,P<0.05.结论 融合蛋白TAT-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用.

pET14b-His-TAT-ERK2和无活性突变体pET14b-His-TAT-ERK2(AF)原核表达载体的构建和表达

目的:构建基于转录激活因子(TAT)技术的细胞外信号调节激酶(ERK)2及其无活性突变体ERK2(AF)原核载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术从pcDNA3-Flag-ERK2和pcDNA3-Flag-ERK2(AF)质粒中扩增出ERK2和ERK2(AF)基因,插入pETl4b-His-TAT载体中,构建重组质粒pET14b-His-TAT-ERK2和pETl4b-His-TAT-ERK2(AF),并诱导原核表达、纯化融合蛋白.采用Western blot方法检测表达蛋白的His标签.结果:酶切和测序结果表明.扩增的ERK2和ERK2(AF)基因正确,大小为1 082 bp;10%SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白,大小为41 kD;Western blot检测显示,原核蛋白带有His标签.结论:成功构建了ERK2和ERK2(AF)的原核表达载体,该载体能在大肠杆菌中表达,纯化得到了His-TAT-ERK2和His-TAT-ERK2(AF)蛋白,为研究ERK2蛋白的功能提供了重要工具.

蛋白转导技术在胰腺干细胞分化中的应用

蛋白转导是将具有生物学活性的目的 片段与蛋白转导结构域相连接,然后导入细胞中并发挥其生物学效应的一项技术.蛋白转导结构域是一种小分子多肽,不仅具有穿透细胞膜的功能,同时也能够保持其融合蛋白的活性.蛋白转导技术是一项新兴的生物学技术,自从这项技术发明以来,被广泛的应用到了细胞基因调控的各个方面.本文以Tat、Pdx-1、Beta2/NeuroD转导蛋白为例,综述蛋白转导技术在胰腺干细胞分化中的应用.

Smad与创伤愈合

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)属于TGF-β细胞因子超家族,在细胞的生长和分化、细胞外基质的合成、创伤修复、机体免疫调节、胚胎发育等多种生理和病理过程中发挥重要作用,是目前公认的与创伤愈合关系密切的细胞因子之一.TGF-β通过特定的信号转导途径,调节相应靶基因的表达,进而调控多样化的生物学效应,因此关于其信号转导方面的研究一直备受瞩目.近年来,TGF-β信号转导分子Smad家族的发现使研究日趋深入和完善,TGF-β信号经跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体转导至细胞内,再由Smad蛋白转导至细胞核.与此同时,Smad在创伤愈合及瘢痕中的作用及其机制,渐渐成为学者们关注的问题.

稳定表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的 建立能够稳定分泌表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系.方法 依次将合成的编码TAT蛋白转导域和EGFP的DNA片段插入分泌型真核表达载体pSecTag2A,构建编码TAT-EGFP融合蛋白的重组质粒,转染Vero细胞后,经Zeocin筛选建系,通过荧光显微镜和免疫印迹鉴定表达的蛋白,MTT分析细胞毒性,荧光观察蛋白转导活性.结果 成功获得了稳定分泌表达TAT-EGFP融合蛋白的工程细胞系,表达的TAT融合蛋白具有良好的蛋白转导活性.结论 建立的哺乳动物细胞表达系统能够持续产生具有蛋白转导活性的TAT融合蛋白,为相关应用研究奠定了基础.

081 蛋白转导技术为脑缺血提供新的治疗途径

PTD-BDNF对海马神经元兴奋性突触活动的作用

目的:研究具有跨血脑屏障功能的PTD-BDNF对培养海马神经元细胞自发电活动的作用.方法:应用全细胞膜片钳技术,观察脑源性神经营养因子(BDNF)和蛋白转导结构域-脑源性神经营养因子(PTD-BDNF)对原代培养大鼠海马神经元自发突触活动的影响.结果:与对照组比较,BDNF与PTD-BDNF作用后均可明显增加海马神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的产生频率[sEPSC的频率:(1.4±0.5)vs(4.0±0.6),(3.9±0.5)Hz,均为P<0.01;mEPSC的频率:(4.2 4±1.0)vs(7.9±1.9),(7.6±1.8)Hz,均为P<0.01],并增加sEPSC的幅度但并不影响mEPSC的幅度[sEPSC的幅度:(415.7±48.0)vs(743.7±95.7),(693.7±99.9)pA,均为P<0.01;mEPSC的幅度:(34.7±4.7)vs(36.3±6.2),(36.2±4.4)pA,均为P>0.05].BDNF与PTD-BDNF两者之间比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论:PrD-BDNF可以增强大鼠海马神经元兴奋性突触活动,说明重组PTD-BDNF与BDNF有相似的电生理活性.

穿膜肽凋亡素融合蛋白诱导黑色素瘤细胞凋亡的实验研究

目的 探讨新型细胞穿膜肽hPP10和凋亡素Apoptin融合蛋白介导小鼠黑色素瘤细胞B16凋亡的效应.方法 构建pET15b-hPP10-Apoptin、pET15b-Apoptin原核表达质粒,经IPTG诱导和NI-NTA树脂纯化后得到融合蛋白;运用TUNEL法体外检测hPP10-Apoptin诱导B16细胞的凋亡效应;制备荷瘤小鼠模型,并在体内检测hPP10-Apoptin融合蛋白的抗肿瘤能力.结果 融合蛋白hPP10-Apoptin经Western blot鉴定正确,且此融合蛋白能在体内外有效诱导B16黑色素瘤细胞凋亡.结论 新型细胞穿膜肽hPP10可有效携带Apoptin穿透细胞膜并发挥抗肿瘤作用.

PTD-BDNF对海马神经元钠、钾、钙离子通道的影响

目的 研究PTD-BDNF对大鼠海马神经元细胞钠、钾、钙离子通道的影响.方法 全细胞膜片钳技术记录海马神经元细胞电压依赖性钠、钾、钙通道电流,观察并分析PTD-BDNF对离子通道电流的影响.结果 与对照组比较,PTD-BDNF、BDNF使海马神经元钠通道电流强度峰值分别增加39.35%和41.99%(n=4,P<0.01);使钠通道电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01);使海马神经元钙通道电流强度峰值分别增加39.20%和38.72%(n=4,P<0.01);使钙通道电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01);使海马神经元钾通道电流IA、IK在20mv刺激处分别比对照组降低29.03%、28.06%和29.76%、33.38%;使钾电流-电压关系曲线下移(n=4,P<0.01).PTD-BDNF与BDNF两者之间比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 PTD-BDNF显示了与脑源性神经营养因子相似的电压依赖性离子通道的调节作用,说明PTD-BDNF与脑源性神经营养因子在调节神经元静息膜电位、神经兴奋性方面有相同的分子基础.

蛋白转导技术在新生儿缺氧缺血性脑病中应用研究进展

新生儿缺氧缺血性脑损伤是我国新生儿急性死亡和慢性神经系统后遗症的重要原因之一.目前新生儿缺氧缺血性脑药物治疗效果不佳,主要原因是药物无法通过血脑屏障.蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)是指一类能携带其他生物大分子（蛋白多肤、DNA、寡核苷酸等）穿过多种哺乳动物细胞并使其在细胞内积聚的小分子阳离子多肤.PTD能携带生物大分子物质透过血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB),这为我们研究、治疗中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病提供了新的思路.本文就PTD的结构特征、转导过程、与物质连接方式、CNS疾病治疗现状等方面来阐述PTD在新生儿缺氧缺血性脑病中的应用前景.

载体跨膜转运介导蛋白或肽类大分子物质通过肾小球滤过屏障的研究

毛细血管内的物质及各种药物从血液滤过到肾小球囊腔,必须经过由有孔的内皮、基膜和上皮细胞之间裂孔三层结构组成的肾小球滤过屏障(glomerular filtration bartier),该滤过屏障具有高度的通透性和选择性.

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的 研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力.方法 用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性.结果 EGFP蛋白不能进入细胞内.PEP-1-EGFP融合蛋白可在5 min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27 h仍可观察到微量绿色荧光.PEP-1-EGFP蛋白浓度达200 μmol/L时对细胞仍无毒性.结论 PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础.

蛋白转导在基因治疗中的应用

蛋白转导是近几年生命科学领域发现的一种独特现象,具有蛋白转导功能的蛋白通过几个短的碱性小肽组成的蛋白转导域(proteintransduction domain,PTD)的介导,能将与其共价连接的DNA、多肽或蛋白质以及其他大分子物质通过非经典途径穿过细胞膜甚至血脑屏障,并在细胞间自由传递.PTD这种能携带融合蛋白自由进入细胞的独特功能为人类一些疾病的基因治疗提供了一种新的运载工具,在基因治疗中有着美妙的应用前景.

PTD-BCR/ABL-OD融合癌蛋白的表达和跨膜转运

寡聚化结构域(oligomerization domain,OD)是BCR/ABL融合蛋白N端的一个重要结构域,是2个单体通过N末端螺旋易位,然后在C末端螺旋间形成反向卷曲折叠形成二聚体,进而互相叠套形成四聚体.在几种不同类型的Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病(CML)患者中可以观察到这种四聚体的形成,它能介导BCR/ABL融合蛋白多聚体的形成,进而使无活性的ABL蛋白的酪氨酸激酶活化[1,2].因此,如果能够利用外源性的OD结构域蛋白干预内源性蛋白的聚合,从而达到抑制BCR/ABL蛋白激酶活化的作用.我们在以前工作的基础上,采用PCR扩增OD区基因片段,并在其N端融合蛋白转导结构域(PTD)基因后,构建原核表达载体,然后在大肠杆菌中进行表达.纯化表达的融合蛋白,并加入到培养的K562细胞中,对OD结构域蛋白在细胞中的作用进行了初步探讨.

重症急性胰腺炎胰腺组织血小板活化因子受体基因表达变化

近年来血小板活化因子(PAF)信号转导通路在重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中的意义引起了人们的关注.PAF是一种由多种细胞产生又可作用于多种细胞的内源活性物质,具有广泛的生物学效应.它通过与PAF受体结合,使G蛋白转导激活磷脂酶C、磷脂酶A2、腺苷酸环化酶和酪氨酸蛋白激酶[1],从而导致SAP的发生和发展.SAP时血中PAF含量显著增加[2],是否会刺激PAF受体数量增加从而扩大PAF对组织细胞的损害,本实验从胰腺组织PAF受体的mRNA水平进行研究.

大鼠胰腺细胞表达血小板活化因子受体

血小板活化因子(PAF)是一种由多种细胞产生并可作用于多种细胞的内源活性物质,具有广泛的生物学效应.它与PAF受体(PAF-R)结合,通过G蛋白转导激活磷脂酶C、磷脂酶A2、腺苷酸环化酶和酪氨酸蛋白激酶等,从而参与炎症反应[1].PAF-R是PAF发挥作用的关键因素.国内外学者采用多种方法研究PAF-R在多种组织的定位.但据文献报道PAF-R在胰腺内仅分布在胰腺组织微血管中[2],难以解释PAF是急性胰腺炎发生发展中的关键因素.我们采用了与文献不同的针对N端的PAF-R抗体,对PAF-R在胰腺组织的定位进行了研究,并且以表达量多的肺组织作为阳性对照,检验实验的可靠性.

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

目的:探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果.方法:合成编码HIV-Tat47-57(Tat11)的2条寡核苷酸单链,两端分别引入BamH Ⅰ和HindⅢ两个酶切位点,退火形成寡核苷酸双链,15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果;以r-pAs16Dr为模板,通过PCR扩增HSV1-TK基因,定向克隆至原核表达载体pET32中.将含pET-32c-Tat11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组化分析重组蛋白Tat11-TK的膜结合特性,蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力,检测和分析TK/GCV、Tat11-TK/GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用.结果:表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60 700左右显示条带,符合Tat11-TK与表达标签融合蛋白的理论值,并证明以包涵体的形式表达;通过Ni2+螯合柱亲和纯化获得的Tat11-TK重组融合蛋白,经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面,蛋白印迹结果说明Tat11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内,同时应用低浓度前药更昔洛韦(GCV,150μmol/L)能有效抑制HepG2细胞生长.结论:Tat 11-TK在原核系统获得高效表达,具有较强的穿膜能力和前药酶活性.

蛋白转导及其在缺血性卒中的应用

由于血脑屏障的存在,中枢神经系统的药物治疗存在一定的困难.人们采用颅内微注射、转运载体法来避开血脑屏障,但上述方法为有创性,且操作复杂.近年来,人们发现蛋白转导结构域具有穿透细胞膜的能力,并能携带大分子肽类通透细胞膜进入细胞内发挥生物活性.文章对蛋白转导、转导机制及在缺血性卒中的应用进行了综述.

hCu,Zn-SOD-TAT PTD的融合表达及其跨膜转运性质的初步研究

HIV-I反式激活蛋白TAT中的一段富含碱性氨基酸的短序列具有独特的跨膜转运能力,被称为TAT蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD).从人肺cDNA文库中PCR扩增hCu,Zn-SOD基因,插入pUC19测序;以测序质粒为模板,再用含TAT PTD编码序列的3'引物PCR扩增得hCu,Zn-SOD-TATPTD融合基因,并插入pUC19.将SOD基因和SOD-TAT PTD融合基因分别亚克隆至温控表达载体pJW2,转化大肠杆菌DH5α.SDS-PAGE和Western blot结果表明,热击诱导4h后,分别在19 ku和22 ku处出现SOD和SOD-TAT PTID目标表达条带,表达蛋白以包含体形式存在.分别提取SOD和SOD-TAT PTD包含体,复性纯化后SOD和SOD-PTD重组蛋白均具有特异的SOD酶活性,其比活性分别为12×103 NU/mg和9.9×103 NU/mg.细胞试验结果表明,与SOD相比较,SOD-TAT PTD融合蛋白能显著提高细胞内SOD酶活力.