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老年COPD患者急性加重期血浆D-D、TAT和PAP含量的检测及意义
目的：老年COPD患者的急性加重期患者的血浆D-D、TAT及PAP含量明显较高，容易导致患者的血栓形成，出现弥散性血管内凝血，导致患者死亡，在临床当中联合检测患者的D-D、TAT及PAP可以有效地掌握患者的临床情况及治疗效果。本次研究主要针对老年COPD患者急性加重期的临床检测，结合文献资料，研究血浆D-D、TAT及PAP在患者病症中的表达，为临床治疗提供一定的参考。
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DMSO增强原核表达TAT-EGFP(Apoptin)穿膜效应的研究
目的:构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP(Apoptin)重组子.转化大肠杆菌,1 mM IPTG诱导TAT-EGFP(Apoptin)融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化.培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1 h,观察TAT-EGFP进人细胞的情况.同时用TUNEL 检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况.结果:成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP(Apoptin)重组子,纯化了分子质量约为30 KD的融合蛋白TAT-EGFP和17 KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强.结论:通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.
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血栓前状态分子标志物在手术患者围术期的动态变化及其临床意义
本研究旨在观察手术患者围术期血浆血栓前状态分子标志物的动态变化,为临床判断血栓前状态、对高危患者采取早期干预措施提供实验依据.选择40例妇科、泌尿科恶性肿瘤(未转移)、20例良性肿瘤和非肿瘤手术患者及20例健康体检者纳入分析.于术前、术后6小时、3天、7天分别用ELISA、透射免疫比浊法检测其血浆血栓前状态分子标志物D-二聚体、血栓前体蛋白(TpP)、凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)、组织因子(TF)、P选择素(P-S)、组织途径抑制物(TFPI)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的水平.结果表明:恶性肿瘤患者术后6小时,血浆TF、TpP、D-D、P-S、TAT水平高于术前,TFPI、PAI-1水平降低,差异有显著性意义;术后3天TF、TpP、D-D持续升高,PAI-1开始升高,与术前比较差异显著,P-S、TAT有所下降但仍高于术前;术后7天TpP、TAT、P-S、TFPI、PAI-1基本恢复到术前水平,TF、D-D与术前比较差异还有显著性意义.良性疾病、非肿瘤手术患者除TF、PAI-1术后6小时高于术前外,上述标志物术后各时间点与术前比较差异不显著.结论:妇科、泌尿科肿瘤患者围术期血浆血栓前状态分子标志物在术后6小时处于凝血与纤溶激活的高水平;术后3天以高凝状态为主,术后7天上述标志物基本恢复到术前水平.良性疾病患者术后6小时分子标志物处于轻度高凝状态.
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依赖HIV-1Tat的毒素蛋白MazF表达系统的建立
目的 建立HIV-1 Tat依赖的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR系统.方法 分别扩增HIV-1 U3TAR和MazF基因片段,通过重叠PCR将U3TAR和MazF连接起来,并TA克隆到pMD18T载体中.通过PCR为MazF引入HA标签,获得U3TAR-MazF-HA.经过双酶切和连接反应,将U3TAR-MazF-HA反向插入到pcDNA3.1,获得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR.将GFP基因正向插入到MazF基因之后,为该载体引入了荧光报道基因,获得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.结果 与pcDNA3.1-tat-flag的共转染实验证明,构建的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依赖的.对比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染的细胞,共转染的细胞具有更少的绿色荧光信号,表明表达的MazF可以下调报道基因GFP的表达.结论 pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建,为探索基于MazF的艾滋病基因治疗方案提供了载体工具.
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破伤风人免疫球蛋白过敏的抢救护理体会
破伤风是厌氧菌破伤风杆菌产生的破伤风外毒素引起的一种急性危重疾病.近20年,破伤风的患病率有逐年下降的趋势,这归功于绝大多数国家采取了计划免疫(小儿注射百、白、破混合制剂)措施有关.但如果发病,仍极具威胁性.所以,预防工作很重要.人类应用精制破伤风抗毒素(TAT)防治破伤风已近百年,在我国也有半个多世纪,曾挽救了许多人的生命.但TAT系马血清制品,其马血清蛋白对人体有很强的过敏原性,常引起过敏反应.
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复合功能传递系统的结构、铁转递蛋白的传递联系和药物载体的磁性颗粒
This paper describes a new formulation of magnetic nanoparticles coated by a novel polymer matrixO-Carboxylmethylated Chitosan (O-CMC) as drug/gene carrier. The O-CMC magnetic nanoparticles were derivatized with a peptide sequence from the HIV-tat protein and transferrin to improve the translocational property and cellar uptake of the nanoparticles. To evaluate the O-MNPs-Tat-Tf as drug carriers, Methotrexate (MTX) was incorporated as a model drug and MTX-loaded O-MNPs-Tat-Tf with an average diameter of 75nm were prepared and characterized by TEM, AFM and VSM. The cytotoxicity of MTX-loaded O-MNPs-Tat-Tf was investigated with C6 cells. The results showed that the MTX-loaded O-MNPs-Tat-Tf retained significant antitumor toxicity; additionally, sustained release of MTX from O-CMC nanoparticles was observed in vitro, suggesting that the O-MNPs-Tat-Tf could be a novel magnetic targeting carrier. We also studied the ability of O-MNPs-Tat-Tf crossing BBB in rats by single photon emission computed tomography (SPECT).
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融合蛋白TAT-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究
目的 观察融合蛋白TAT-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用.方法 含80 nmol/L浓度TAT-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60 min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予TAT-NEP1-40、TAT-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst 33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察TAT-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用.结果 (1)TAT-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,TAT-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,P<0.05.结论 融合蛋白TAT-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用.
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血液分析自动审核规则建立与验证的多中心研究
目的 建立可用于血液分析检验结果自动审核的规则,为血液分析不同检测系统提供建立和验证自动审核规则的思路,在保证检验质量的同时缩短TAT时间.方法 多中心研究收集来自吉林大学第一医院等八家医院检验科2017年1月至11月期间的EDTA-K2抗凝血常规样本共34629例:规则建立组3478例,其中差值检查(Delta check)288例;规则验证组5362例,其中Delta check 2494例;临床试应用组25789例.应用Sysmex XN系列全自动血液分析仪检测血常规,同时制备血涂片、染色、镜检,将临床信息、设备参数、检测结果和镜检结果汇总;利用统计学方法筛选自动审核条件(包括项目和cut-off值);将自动审核条件录入仪器软件;进行模拟条件的一期验证以及检测后样本二期验证,分别计算真阴性、假阴性、真阳性、假阳性、自动审核通过率和通过正确率;应用确定的自动审核条件自动审核血常规结果验证漏检率、得出自动审核通过率和TAT时间.结果 (1)自动审核规则涉及白细胞、红细胞、血小板、Delta check及性状异常共43条.(2)规则建立组中3190例样本其假阴性为1.94%(62/3190)(P<0.001),自动审核通过率为76.74%、通过正确率为97.47%;规则验证组中2868例样本其假阴性为3.38%(97/2868)(P=0.002),自动审核通过率为42.26%、通过正确率为92.00%;规则建立组288例和规则验证组2494例Delta check假阴性分别为1.39%和2.61%(P<0.001).(3)三家医院试应用自动审核规则,检测的25789例血常规样本,检验结果报告平均TAT缩短分别为24、32、7 min,30 min内发报告率分别提高33%、53%和7%,自动核通过率为72%~74%.结论 应用血液分析自动审核规则43条能够在保证检验质量的同时缩短TAT,提高血常规检验工作效率.值得指出的是,在临床应用时,对于与本研究相同型号的检测系统,应用前应进行验证,并在应用中做周期性验证;对于不同型号的检测系统,本研究提供其建立血液分析自动审核规则的方法,可结合检测系统的技术参数建立适合各自的自动审核规则.
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TAT-EGFP融合蛋白的表达及其在小鼠体内跨膜转导与分布的研究
目的:建立TAT-EGFP融合蛋白在原核细胞中表达的试验方法,探讨该融合蛋白经过胎盘屏障后在小鼠体内跨越各种生物膜转导及分布情况.方法:将重组表达栽体pET32-TAT-EGFP转化E ColiBL21,得到稳定表达的融合蛋白,纯化后注入孕鼠腹腔内,注射后第3天分别取母鼠和仔鼠组织,并做快速冷冻切片,观察融合蛋白在小鼠体内的分布.结果:成功表达了相对分子质量为32×103的TAT-EGFP融合蛋白.该融合蛋白能在小鼠不同组织细胞内分布,在小肠上皮分布为明显, 并能透过胎盘及血脑屏障.结论:TAT介导的EGFP可在小鼠体内广泛跨膜转导分布,为进一步研究其他大分子活性物质进入细胞及其功能奠定了良好基础.
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具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定
目的 建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统.方法 应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒.将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能.结果 所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的 融合蛋白.细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性.结论 成功构建了pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体,并获得了具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白,为进一步研究细胞内蛋白相互作用、细胞穿透肽TAT的功能及其穿透细胞的机制奠定了基础.
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稳定表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系的建立
目的 建立能够稳定分泌表达TAT融合蛋白的哺乳动物细胞系.方法 依次将合成的编码TAT蛋白转导域和EGFP的DNA片段插入分泌型真核表达载体pSecTag2A,构建编码TAT-EGFP融合蛋白的重组质粒,转染Vero细胞后,经Zeocin筛选建系,通过荧光显微镜和免疫印迹鉴定表达的蛋白,MTT分析细胞毒性,荧光观察蛋白转导活性.结果 成功获得了稳定分泌表达TAT-EGFP融合蛋白的工程细胞系,表达的TAT融合蛋白具有良好的蛋白转导活性.结论 建立的哺乳动物细胞表达系统能够持续产生具有蛋白转导活性的TAT融合蛋白,为相关应用研究奠定了基础.
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穿透肽TAT融合表达载体的优化及其靶向应用的初步研究
目的 设计并构建分别位于融合蛋白氨基端和羧基端的穿透肽TAT表达载体,比较两种融合蛋白的内化差异,并利用TAT将凋亡素VP3转导入细胞内,检测其促凋亡活性.方法 荧光显微镜观察His-TAT-EGFP和His-EGFP-TAT融合蛋白内化效率的差异,并利用Western blotting检测内化入细胞的蛋白量.将VP3序列插入到内化效率高的穿透肽载体pET14b-EGFP-TAT中并诱导表达蛋白,观察该蛋白在不同细胞系(HeLa、HEK293、3T3、PC-3)的内化;利用DAPI染色观察该融合蛋白诱导HeLa细胞凋亡后核小体的形成,MTT法检测细胞存活率.结果 在蛋白浓度梯度实验中,荧光显微镜观察和Western blotting检测均显示His-EGFP-TAT融合蛋白的内化效率明显高于His-TAT-EGFP融合蛋白.在不同种类细胞中均可观察到His-VP3-EGFP-TAT内化的强荧光颗粒;该蛋白和对照蛋白(His-EGFP-TAT)孵育HeLa细胞48h后,His-VP3-EGFP-TAT孵育细胞中可观察到核小体形成,MTT法检测该组细胞的存活率在500、1000、2000nmol/L蛋白作用下分别为87.23%士2.09%、53.01%±1.79%和42.52%±1.90%,与His-EGFP-TAT孵育细胞存活率(分别为97.21%士1.41%、95.72%±1.26%和94.35%±1.67%)比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 TAT位于融合蛋白羧基端的蛋白内化活性高于位于氨基端的蛋白,His-VP3-EGFP-TAT融合蛋白可以高效内化进入不同的细胞系,并能有效诱导细胞凋亡.
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His-TAT-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位
目的 构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-TAT)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HW-TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HW-TAT的跨膜转导机制及其定位提供重要工具. 方法 采用基因重组技术构建含HIV-TAT以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-TAT-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌.将纯化的His-TAT-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察. 结果 PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-TAT-mCher-ry融合蛋白.荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布. 结论 成功构建了pET14b-His-TAT-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-TAT-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-TAT的跨膜转导机制提供了一个重要的工具.
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穿膜肽TAT的表达与活性的初步研究
目的:构建原核表达载体,获得纯化的融合蛋白TAT-GFP,以便于考查TAT的细胞定位及穿膜功能.方法:将TAT基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导融合表达.分离纯化的融合蛋白与BHK-21细胞共孵育一定时间后,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位;同时以尾静脉注射方式进行小鼠给药实验,一定时间后麻醉,将主要器官组织取出、固定、冰冻切片,荧光显微镜下观察蛋白的分布情况.结果:DNA测序证明成功构建融合蛋白表达载体pET28a-tat-gfp.经诱导表达、纯化可获得纯度为85%以上的融合蛋白TAT-GFP.细胞实验表明,融合蛋白可迅速透过细胞膜并广泛分布于BHK-21细胞内,其中尤以细胞核内多,而对照组GFP蛋白则不能穿透细胞膜入胞;动物实验中,给药2 h后即可观察到TAT携带GFP到达小鼠的各主要器官和组织,甚至穿透血脑屏障分布于脑组织部分.结论:融合表达的穿膜肽TAT具有一定的携带生物分子(GFP)穿膜功能,本研究为深入了解TAT的性质及其未来应用奠定了一定的基础.
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Tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定
目的 确定Tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点.方法 构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down 、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位.结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现Tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位.结论 Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱.
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破伤风抗毒素皮试阳性因素的探讨
目的 探讨降低破伤风抗毒素(TAT)皮试阳性率的方法.方法 破伤风抗毒素(TAT)皮试患者490例,按患者门诊就诊的时间先后分5-9月271例为A组按传统方法配制皮试液,和10-12月219例为B组按改进方法配制皮试液.A组按传统方法配制皮试液:取TAT 0.1ml再取生理盐水至1ml,取0.1ml皮内注射,20min后观察结果;B组按改进方法配制皮试液:取生理盐水至0.2ml再取TAT至0.3ml后取生理盐水至0.9ml,取0.1ml(15IU)皮内注射,20min后观察结果.结果 两组TAT皮试的阳性率有明显差异,B组患者的阳性率明显低于A组,具有统计学差异(P<0.01).结论 此方法确实能降低TAT皮试的阳性率.减少了患者因脱敏多次肌注的痛苦,且节省时间.
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聚乙烯吡咯烷酮预处理培养细胞促进TAT穿膜效率
目的:探讨PVP预处理细胞对TAT穿膜效率的影响及其作为促渗剂的安全性,以优化TAT穿膜条件.方法:人工合成荧光标记短肽TAT-FITC和作为阴性对照的无意义肽NCO-FITC作用于PVP预处理各种细胞株,荧光显微镜观察TAT-FITC的穿膜效率及其定位；荧光酶标仪定量检测不同预处理的各种细胞摄取荧光标记短肽；MTT检测PVP对各种细胞的存活率及溶血实验检测其对细胞膜结构完整性的影响.结果:经PVP预处理细胞后,TAT-FITC可有效穿膜进入细胞内,MTT结果显示适当浓度的PVP对细胞活力几乎没有影响；溶血实验也证实,PVP不影响红细胞的细胞膜完整性.结论:本实验观察显示,PVP可以明显提高TAT对培养细胞的穿膜效率,但对细胞活力影响很小.
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反式激活蛋白-氧依赖性降解结构融合结构域介导蛋白跨膜转运和氧依赖性降解作用
目的 研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用.方法 将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因.将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白.同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照.在20% O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性.小鼠尾静脉注射不同融合蛋白( 10 mg·kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性.结果 由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织.TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20% O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1% O2细胞及组织中.结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜.引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1% O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中.
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破伤风抗毒素注射液致缓发性荨麻疹1例
病例:患者,男,31岁,因"外伤致左膝盖损伤"于2009年10月28日来我院就诊.急诊科医生清创术后,予破伤风抗毒素(TAT)注射液1 500U(江西生物制品研究所生产,批号20090420-8).先行在右前臂内侧使用15U TAT皮试,20min后皮试局部无红肿、硬结、水泡形成和其他不适,遂予右臀部肌内注射TAT 1 500U,注射后留观30min后无不适症状,自行回家休息.
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TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究
目的 构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内.结果 TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白.结论 构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础.
关键词： TAT 核苷二磷酸激酶A蛋白 融合蛋白
