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穿膜肽与P-选择素抗体修饰的载基因超声造影剂的制备及体外靶向实验研究
目的 制备穿膜肽与P-选择素抗体修饰的载基因超声造影剂,并在体外评价其靶向结合能力.方法 采用机械振荡法制备载基因及穿膜肽超声造影剂,激光共聚焦显微镜观察质粒DNA和穿膜肽的分布,并用碳二亚胺法制备P-选择素靶向超声造影剂,通过免疫荧光法检测其与抗体的连接情况.制备人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧模型,光镜及流式细胞仪检测该靶向超声造影剂与缺氧HUVEC的结合情况.结果 激光共聚焦显微镜可以观察到穿膜肽和质粒DNA均匀地分布在超声造影剂壁上.通过免疫荧光法在荧光显微镜下观察到靶向超声造影剂表面呈红色荧光.体外寻靶实验显示,光镜下靶向组超声造影剂牢固地结合在缺氧HUVEC周围,而非靶向组未见超声造影剂结合;流式细胞仪检测靶向组大约有73.80％的细胞表面结合有该靶向超声造影剂.结论 成功制备了穿膜肽与P-选择素抗体修饰的载基因超声造影剂,并具有较强的靶向结合能力.
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超声微泡联合穿膜肽促基因转染治疗急性心肌梗死的动物实验研究
目的 探讨超声微泡联合穿膜肽介导HGF基因治疗大鼠急性心肌梗死的可行性.方法 将40只SD大鼠建成心肌梗死模型后随机分为5组,即①空白对照组(C),②超声+空白微泡组(US+ MB),③超声+载穿膜肽微泡组(US+ MBTAT),④超声+载基因微泡组(US+MBHGF),⑤超声+载基因及穿膜肽微泡组(US+MBHGF+ TAT).于基因转染后7d处死各组大鼠,激光共聚焦显微镜观察pIRES2-EGFP-HGF在大鼠心肌内的表达情况.偏振光显微镜观察Ⅰ、Ⅲ型胶原在大鼠梗死心肌周边区的分布情况.免疫组织化学法(IHC)检测梗死心肌周边区CD34的表达,并在显微镜下计数心肌内新生微血管密度(MVD).RT-PCR及Western Blot检测HGF的mRNA及蛋白的表达.结果 US+MBHGF+TAT组的绿色荧光强度高于其他各组,Ⅰ、Ⅲ型胶原明显少于其他各组,HGF mRNA及HGF蛋白的表达均高于各组,IHC结果显示新生的微血管被染成棕黄色,US+ MBHGF+TAT组的MVD高,与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 超声微泡联合穿膜肽能够介导HGF基因在缺血心肌内的高效转染,并促进血管新生和改善纤维化,为缺血性心脏病的基因治疗提供一种新的基因转移途径.
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穿膜肽纳米类脂质体包载利多卡因的透皮特性及表面麻醉效果初探
目的 研究穿膜肽纳米类脂质体包载利多卡因(lidocaine hydrochloride loaded transactivator of transcription peptide conjugated nano-niosome,LID-TAT-N)在动物体内外透皮情况及其表面麻醉效果,为研制新型口腔表面麻醉剂提供依据.方法 制备LID-TAT-N,传统脂质体包载利多卡因(lidocaine hydrochloride loaded conventional liposome,LID-CL),分别检测粒径、电势和包封率.用离体小鼠皮进行12h体外透皮实验,测定并比较LID-TAT-N组、LID-CL组、利多卡因注射液(LID injection,LID-IJ)组(每组样本量为6)单位面积累计透过量;通过兔角膜反射比较LID-TAT-N组、LID-CL组和LID-IJ组(每组样本量为6)表面麻醉效果.结果 LID-TAT-N组脂质体粒径[(152.7±10.6) nm]显著小于LID-CL组[(259.5±15.5) nm,P＜0.01].LID-TAT-N组12 h单位面积累计透过量达(1 340.0±97.5) μg·cm-2,显著高于LID-CL组[(1 060.6±80.2) μg·cm-2]和LID-IJ组[(282.6±65.1)μg·cm-2](p＜0.05).LID-TAT-N组具有表面麻醉效果,其麻醉持续时间[(24.8±2.8) min]显著长于LID-IJ组[(14.5±2.3) min,P＜0.05],与LID-CL组[(21.3±5.6)min]差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LID-TAT-N具有良好的透皮能力,有表面麻醉效果.
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穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND作为药物载体的生物安全性初步评价
目的 研究一种新的来源于节律蛋白mCLOCK's DNA结合域的穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND(CDB)作为药物携带载体的生物安全性.方法 化学合成穿膜肽CDB.体外采用Phorbol 12-Myristate 13-acetate(PMA)诱导NIH3T3细胞的近日节律.于诱导后不同时间点,CDB与小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞共孵育,RT-PCR检测其对近日节律核心分子mPeriod1(mPer1)基因表达的影响.此外,培养的NIH3T3直接与CDB共孵育12 h和24 h后,MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对细胞周期和凋亡的作用.结果 CDB没有明显影响PMA诱导的mPer1节律基因表达.此外,CDB不干扰NIH3T3细胞增殖及生长周期,亦无明显的诱导凋亡作用.结论 CDB对细胞近日节律、细胞增殖、生长周期及细胞凋亡均无明显毒副效应,可望作为一种安全有效药物载体,并具有广泛的临床应用前景.
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一种新的人源性穿膜肽
目的观察一种新的人体蛋白结构域(Circadian locomoter output cycles kaput protein′s DNA-binding peptide, hCLOCK′s DNA_BIND)对细胞膜的穿透过程.方法化学合成hCLOCK′s DNA_BIND,N端标记FITC荧光素,与培养的血管内皮细胞(ECV-304)和原代培养的神经胶质细胞孵化后,荧光显微镜下观察并进行荧光强度分析.结果 hCLOCK′s DNA_BIND能够有效通过细胞膜屏障,内化的量随孵化时间和肽段浓度的增加而增加,但温度的改变对其似乎没有影响.结论 hCLOCK′s DNA_BIND具有很强的内化作用,为研究药物安全透过细胞膜屏障的载体提供了有效途径.
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穿膜肽TAT的表达与活性的初步研究
目的:构建原核表达载体,获得纯化的融合蛋白TAT-GFP,以便于考查TAT的细胞定位及穿膜功能.方法:将TAT基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导融合表达.分离纯化的融合蛋白与BHK-21细胞共孵育一定时间后,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位;同时以尾静脉注射方式进行小鼠给药实验,一定时间后麻醉,将主要器官组织取出、固定、冰冻切片,荧光显微镜下观察蛋白的分布情况.结果:DNA测序证明成功构建融合蛋白表达载体pET28a-tat-gfp.经诱导表达、纯化可获得纯度为85%以上的融合蛋白TAT-GFP.细胞实验表明,融合蛋白可迅速透过细胞膜并广泛分布于BHK-21细胞内,其中尤以细胞核内多,而对照组GFP蛋白则不能穿透细胞膜入胞;动物实验中,给药2 h后即可观察到TAT携带GFP到达小鼠的各主要器官和组织,甚至穿透血脑屏障分布于脑组织部分.结论:融合表达的穿膜肽TAT具有一定的携带生物分子(GFP)穿膜功能,本研究为深入了解TAT的性质及其未来应用奠定了一定的基础.
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穿膜肽AR-23增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率及其机制的初步研究
目的 研究穿膜肽AR-23[蜂毒肽相关肽,来自日本蛙(Rana tagoi)]的极性电荷区对细胞穿膜作用的影响及其在促进聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导的基因转染中的作用.方法 分别合成了穿膜肽AR-23及由疏水核心区组成的截短肽AR-20;利用圆二色谱(CD)分析二级结构;通过溶血实验比较两者的细胞膜穿透能力;利用去极化实验分析穿膜肽与细胞膜的相互作用方式;将穿膜肽与PEI按一定比例混合,以绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(luciferase)为报告基因检测基因在HeLa和RAW264.7细胞中的转染效率,用MTT法测定基因转染后细胞的毒性.结果 在以甲醇模拟的细胞膜环境中,AR-23呈现出典型的α-螺旋结构,α-螺旋率为37.6%,而AR-20未呈现出典型的α-螺旋结构峰;在偏酸性和中性条件下,AR-23均能穿透细胞膜导致红细胞溶血,而AR-20不具备溶血作用;AR-23对细胞膜具有较强的去极化作用,而AR-20去极化能力极弱;AR-23可明显增强PEI介导的基因在HeLa和RAW264.7细胞中的转染效率,并且不引起转染后细胞的S毒性,AR-20则不具备增强基因转染效率的作用.结论 AR-23的极性电荷区对于维持其α-螺旋结构和穿膜能力至关重要.AR-23能够提高PEI介导的基因转染效率而不会导致细胞毒性,是一种理想的基因转染增强剂.
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穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率的机制研究
目的 研究穿膜肽增强支链聚乙烯亚胺(BPEI)在CHO-K1细胞中的基因转染效率的机制.方法 分别合成蜂毒肽(melittin)及其疏水核心区MT20,利用圆二色光谱(CD)分析其二级结构;通过溶血试验比较二者穿透细胞膜的能力;加入蜂毒肽和MT20前后,观察钙黄绿素(calcein)在HeLa细胞内的分布情况.分别将蜂毒肽或MT20与BPEI按一定比例混合,以荧光素酶(luciferase)为报告基因,检测荧光素酶在CHO-K1细胞中的转染效率;以MTT法检测基因转染后的细胞毒性.结果 在模拟膜环境的甲醇溶液中,蜂毒肽和MT20都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为59.63%和35.67%,说明其二级结构与之穿膜功能相关;蜂毒肽只能在中性条件下穿透细胞膜导致红细胞溶血,而MT20在中性和酸性条件下都具有穿膜能力;加入蜂毒肽和MT20后能够促进钙黄绿素在MT20组中呈弥散分布,在蜂毒肽组中呈颗粒状分布并且在核仁内蓄积;MT20和蜂毒肽都能够增强BPEI在CHO-K1细胞中的基因转染效率,其中MT20的增强作用更强且细胞毒性较蜂毒肽以及单独使用BPEI和Lipofectamine 2000时要低.结论 蜂毒肽的疏水核心区MT20通过增加PEI/DNA复合物颗粒从内含体逃逸并促进其进入细胞核而增加其基因转染效率,是一种低毒的基因转染增强剂,有可能在难以转染的细胞系中发挥重要作用.
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人酸性成纤维细胞生长因子与穿膜肽融合蛋白在鼠体内的药代动力学及血脑屏障通透性研究
研究穿膜肽(transcriptional activator protein,TAT)和人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic fibroblast growth factor,haFGF)融合蛋白TAT-haFGF14-154静脉注射(iv)后在大鼠血浆中的药代动力学特性,并探讨其在大鼠和小鼠体内血脑屏障的通透性,为阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)的临床治疗用药提供依据.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测静脉注射后TAT-haFGF 14-154在大鼠血浆和小鼠脑匀浆液的含量,免疫组织化学法检测大鼠和小鼠脑中的分布.结果表明,大鼠单次颈静脉注射TAT-haFGF14-154 300 μg·kg-1后,血药浓度-时间曲线符合二室开放模型,加权为1/C2,属于线性动力学消除,其中,分布半衰期为(0.049±0.03)h,消除半衰期为(0.55±0.05)h.结果提示,TAT-haFGF14-154在体内消除较快,可以迅速穿过血脑屏障,分布于大脑皮质和海马区,并定位于细胞核.
关键词： 穿膜肽 血脑屏障 药代动力学 酸性成纤维细胞生长因子 阿尔茨海默症 -
pH敏感穿膜肽修饰的载α-半乳糖神经酰胺的脂质体免疫作用机制的初步研究
通过制备pH敏感穿膜肽TH [AGYLLGHINLHHLAHL (Aib) HHIL-Cys]修饰的载免疫佐剂α-半乳糖神经酰胺的脂质体(TH modified liposome loaded with alpha-galactosylceramides,aGC-TH-Lip),并研究其对荷瘤小鼠免疫功能的影响及其作用机制.采用薄膜分散-探头超声法制备脂质体,测定TH修饰的脂质体(TH peptidemodified liposome,TH-Lip)体外被小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)系DC2.4细胞的摄取;给药后荷瘤小鼠体内抗肿瘤相关免疫细胞的激活、促进DC细胞成熟的程度以及辅助性T细胞(helper T cell,Th)的分化情况.结果显示,TH-Lip在体外被DC2.4细胞的摄取量是聚乙二醇修饰的脂质体(polyethylene glycols modified liposome,PEG-Lip)的1.48倍;给药后荷瘤小鼠体内自然杀伤性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞数量分别为(0.43±0.048)％、(12.80±0.50)％和(3.13±0.26)％,成熟DC细胞达到(2.30±0.22)％,细胞毒性T淋巴细胞的数量达到(32.30± 0.80)％,较游离aGC组有显著性差异;αGC-TH-Lip对Th1细胞分化的诱导效应强,对Th2细胞的分化无明显促进作用.此结果表明,该αGC-TH-Lip能够提高小鼠的免疫活性,增强α-半乳糖神经酰胺的作用效果,促进淋巴细胞更多地向细胞免疫的方向分化,从而达到更好的抗癌免疫治疗作用.
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寡聚精氨酸促进胰岛素纳米粒肠道吸收
探索一种穿膜肽寡聚精氨酸[poly(arginine)8,R8]修饰的可生物降解乳酸/羟基乙酸共聚物[poly(lacticco-glycolic acid),PLGA]纳米粒作为胰岛素(insulin,INS)口服给药载体的可行性.采用复乳-溶剂挥发法制备包载胰岛素的PLGA纳米粒(INS-NP),R8经聚乙二醇桥联修饰于该纳米粒表面(R8-INS-NP).对纳米粒进行理化性状表征及体外释放特性考察,并进行正常大鼠在体灌肠给药的药动学与药效学评价.所得纳米粒平均粒径为(179.0±5.2) nm,多分散系数为0.152±0.042,胰岛素包封率为(29.10±2.59)％,载药量为(5.05±0.50)％,体外释放呈先快后慢的两相模式.给药剂量为10 U·kg-1时,R8 -INS-NP的降血糖效果显著优于同剂量的INS-NP,而且D-构型R8修饰的纳米粒(D-R8-INS-NP)吸收优于L-构型R8修饰的纳米粒(L-R8-INS-NP).与皮下注射相比,INS-NP、L-R8-INS-NP和D-R8-INS-NP在体灌肠给药的相对生物利用度分别为0.52％、4.78％和8.39％,药理相对生物利用度分别为2.07％、3.90％和8.24％.纳米粒表面经R8修饰可促进其包载的胰岛素经肠道吸收,为实现多肽、蛋白类生物大分子口服给药提供了新思路.
关键词： 胰岛素 穿膜肽 纳米粒 乳酸/羟基乙酸共聚物 肠道吸收 -
iRGD修饰的阿霉素主动靶向脂质体的细胞毒与抗肿瘤效果评价
本研究拟制备iRGD修饰的阿霉素主动靶向脂质体,对其理化性质、细胞毒和抗肿瘤效果进行评价,并与载阿霉素的被动靶向脂质体、RGD修饰的阿霉素主动靶向脂质体进行比较.首先将同时具有肿瘤细胞靶向和细胞穿透功能的iRGD肽以及RGD肽连接到DSPE-PEG-NHS上得到iRGD及RGD修饰的导向化合物DSPE-PEG-iRGD和DSPE-PEG-RGD;然后采用硫酸铵梯度法制备iRGD、RGD修饰的主动靶向脂质体和被动靶向脂质体;后采用动态光散射测定不同脂质体的粒径,柱层析法测定其包封率,SRB法评价其细胞毒性,荷B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠进行抑瘤效果的评价.结果表明,不同脂质体粒径在90～100 nm,包封率达到95％以上,制备重现性好；在细胞毒性方面,iRGD修饰的脂质体与被动靶向脂质体、RGD修饰的脂质体均无显著性差异；在抗肿瘤效果方面,iRGD修饰的脂质体与RGD修饰的脂质体对荷B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠的抑制肿瘤生长效果显著强于被动靶向脂质体,但二者的抑瘤效果没有显著性差异.综上,iRGD修饰的阿霉素主动靶向脂质体,作为一种药物输送系统,在肿瘤治疗方面有一定的应用前景.
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仿穿膜肽型壳聚糖衍生物N-辛基-N-精氨酸壳聚糖的合成和表征
以壳聚糖为母体,在其侧链氨基上引入亲水基精氨酸以及疏水基辛基,合成了一种新型的具有仿穿膜肽结构的壳聚糖衍生物——N-辛基-N-精氨酸壳聚糖(OACS).同时通过FT-IR、1HNMR、元素分析和精氨酸显色法确证了OACS的化学结构以及其辛基和精氨酸的取代度.荧光光谱法测得系列OACS的临界胶束浓度为0.12～0.27mg·.mL-1;溶解度实验表明其在pH 1～12溶液中均易溶,并可自组装形成淡蓝色略带乳光的胶束溶液；马尔文粒径测定仪显示系列OACS形成的聚合物胶束平均粒径为158.4～224.6nm,多分散系数为0.038～0.309,(ζ)电位为+19.16～+30.80mV;原子力显微镜图谱显示所得胶束粒子分散均匀、大小规则圆整；MTT实验证实所得OACS在50～1000μmol·L-1内安全性能良好.细胞实验结果表明,随着精氨酸取代度的升高,OACS胶束进入细胞的荧光量也随之增加,与壳聚糖相比,大增加倍数可达40倍.因此,OACS有望作为一种兼具促吸收和载药功能的新型纳米载体.
关键词： 壳聚糖 穿膜肽 N-辛基-N-精氨酸壳聚糖 聚合物胶束 -
穿膜肽R8和pH敏感型可断裂PEG共修饰脂质体的构建
本文旨在构建穿膜肽R8 (RRRRRRRR)和pH敏感型PEG(聚乙二醇,polyethylene glycols)共修饰的脂质体(R8 peptide and pH sensitive PEG co-modified liposomes,Cl-Lip)用于乳腺癌的靶向药物传递.通过卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2K-R8和PEG5K-Hz-PE (pH敏感型PEG)为材料制备共修饰脂质体,对其粒径和zeta电位进行表征.采用4T1细胞考察不同预孵育条件下细胞对Cl-Lip的摄取.同时对其入胞途径、溶酶体逃逸能力及肿瘤球穿透能力进行考察.结果表明,Cl-Lip粒径为(110.4±5.2) nm,PDI为0.207±0.039,zeta电位为(-3.46±0.05) mV.体外实验证明,Cl-Lip具有良好的血清稳定性.在不同的预孵育时间点,4T1细胞对Cl-Lip的摄取均呈pH依赖性,在pH 6.0条件下的摄取均高于pH 7.4条件下的摄取.Cl-Lip的入胞机制主要为网格蛋白介导的内吞途径和能量依赖型的内吞途径.在pH 6.0条件下,Cl-Lip具有较强的溶酶体逃逸能力和肿瘤球穿透能力.这些结果表明,共修饰脂质体具有较好的pH响应性,是一种潜在的靶向药物传递系统.
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穿膜肽TAT和脑肿瘤靶向肽T7双修饰脂质体的制备和体外靶向性评价
本文旨在制备T7肽和穿膜肽TAT双修饰的脂质体(T7 and TAT dual modified liposomes,T7-TAT-LIP)用于血脑屏障和脑肿瘤细胞双级靶向药物递送.研究以CFPE为荧光探针,T7修饰的PEG-DSPE、TAT修饰的PEG-DSPE、卵磷脂、PEG-DSPE和胆固醇为材料,采用成膜水化法制备脂质体,对T7浓度、TAT浓度、连接T7和TAT的PEG长度进行优化,表征其粒径、zeta电位、形态和稳定性.以bEnd.3细胞和C6细胞为模型,考察T7-TAT-LIP的细胞摄取能力,表征其穿过血脑屏障和脑肿瘤细胞靶向能力.结果表明,T7用量为脂质的6％、修饰T7所用PEG链长为2000、TAT用量为脂质的0.5％、修饰TAT所用PEG链长为1000时所得到的双修饰脂质体被C6细胞摄取能力强.优化后T7-TAT-LIP粒径为118 nm,zeta电位为-6.32 mV,透射电镜下形态圆整.脂质体在PBS中较为稳定,37℃放置24 h,浊度和粒径无明显变化;4～8℃放置1个月,粒径和PDI无明显变化.在不同时间点,bEnd.3和C6细胞摄取T7-TAT-LIP的强度均高于单配体修饰脂质体,且随着孵育时间提高,摄取浓度逐渐提高.这些结果说明,双修饰脂质体具有血脑屏障和脑肿瘤细胞双级靶向能力,且效果优于单配体修饰脂质体.
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具有穿膜功能的嵌合型AVPI-低分子量鱼精蛋白/DNA共给药系统的抗肿瘤研究
本文旨在合成具有穿膜活性的促凋亡AVPI-低分子量鱼精蛋白嵌合多肽(AVPI-LMWP),制备安全有效的AVPI-LMWP/pTRAIL基因共给药系统,通过凋亡肽AVPI与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因(pTRAIL)联合用药来发挥抗肿瘤作用.采用标准固相合成法合成嵌合型多肽AVPI-LMWP.基于静电吸附作用,AVPI-LMWP可与DNA药物形成AVPI-LMWP/pTRAIL复合物,并对其理化性质进行了表征,同时研究其细胞摄取效率和抗肿瘤增殖能力.结果表明,采用共孵育法成功制备了AVPI-LMWP/pTRAIL复合物,随着AVPI-LMWP/pTRAIL质量比的增加,复合物的平均粒径逐渐减小,zeta-电位变化较小.凝胶电泳实验结果表明,当两者质量比大于15∶1时,AVPI-LMWP能完全包裹和压缩质粒pTRAIL.体外细胞摄取实验显示,随着二者质量比的增加,细胞摄取效率有所提高.体外细胞毒性实验表明,AVPI-LMWP/pTRAIL (W∶W=20∶1)复合物抑制HeLa细胞增殖的效果显著强于pTRAIL、AVPI-LMWP及LMWP/pTARIL复合物.研究显示,AVPI-LMWP/pTRAIL基因共给药系统能将质粒高效递送到HeLa细胞内,并能有效地诱导肿瘤细胞凋亡,是具有联合治疗应用价值的多肽/基因共给药系统.
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穿膜肽介导的超微超顺磁性纳米铁颗粒体外标记神经干细胞的实验观察
利用干细胞的多潜能特性进行移植和替代研究是再生医学的重要内容,利用磁性纳米颗粒对干细胞进行标记并进行磁共振实时动态监测是一种非常有前景的干细胞示踪方法[1-3],我们试图通过对超小型超顺磁性纳米铁颗粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)进行表面修饰后连接Tat穿膜肽,探讨这种方法能否将USPIO带人干细胞内,旨在为干细胞的磁共振示踪寻找一条新途径.
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TAT和PEG双修饰田蓟苷复合磷脂脂质体的工艺优化及体外评价
目的 筛选细胞穿膜肽(transcription activator,TAT)和聚乙二醇(polyethylene glycols,PEG)双修饰田蓟苷复合磷脂脂质体(TAT&PEG tilianin CPL,T&PTCPL)的佳制备工艺,并考察其对心肌细胞H9C2的保护作用.方法 采用薄膜分散-超声法制备T&PTCPL,利用3因素3水平的Box-Behnken设计,分别以总磷脂与田蓟苷质量比(X1)、DSPE-PEG2000-TAT的浓度(X2)和水化体积(X3)为考察对象,包封率(y1)、粒径(y2)和多分散系数(PDI,y3)为主要评价指标筛选T&PTCPL佳配方,并以Na2S2O4建立H9C2细胞缺氧/复氧损伤模型,以超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)为指标,考察T&PTCPL对细胞缺氧/复氧损伤的影响,同时,考察其体外释放率(动态透析法)及人结肠癌Caco-2细胞对田蓟苷原料药和T&PTCPL的吸收情况.结果 T&PT℃PL的佳组合为X1=20,X2=1.7％,X3=3.2 mL;包封率为(86.62±2.51)％,粒径为(149.7±8.2) nm,PDI为0.15±0.05.在体外细胞实验中,与模型组比较,原料药组及T&PTCPL组能显著提高SOD活性,减少MDA的含量及抑制LDH和CK-MB的释放(P＜0.05),并且T&PTCPL的效果优于原料药.同时,T&PT℃PL在48 h基本释放完全,累积释放率88.65％,Caco-2细胞对T&PTCPL的吸收效果较佳.结论 Box-Behnken实验设计法用于T&PT℃PL的优化筛选是可行的,数学模型的预测值与实验观察值相符,并且T&PTCPL在体外释放中表现出较好的缓释效果,能促进田蓟苷在Caco-2细胞中的吸收,同时,提示T&PTCPL具有保护心肌缺血再灌注损伤作用.
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重组人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的构建与表达
目的:构建人乳头瘤病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位疫苗并在大肠杆菌中表达.方法:应用多轮PCR的方法合成CTL表位基因序列,将其亚克隆入pET28a表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白质,用Western blotting对重组蛋白进行鉴定.结果:采用计算机表位预测的方法选取HPV6、11、16型的CTL表位,通过5轮PCR人工合成人乳头瘤病毒CTL表位疫苗的基因片段HPVepi,用亚克隆的方法构建了重组表达质粒pET28a-Tat-HPVepi,并在大肠杆菌高效表达了该重组蛋白质,经Western blotting鉴定显示出特异性条带.结论:结合计算机表位预测和PCR的方法构建并在大肠杆菌中高效表达了一种人乳头瘤病毒CTL表位疫苗.
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携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义
目的:构建携带具有穿膜功能的融合报告基因NT4-GFP-Ant基因的重组腺相关病毒载体.方法:应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因;用T4 DNA连接酶将测序正确的GFP与已构建成功的Ant基因片段及PBV220/NT4线性质粒载体定向连接,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取融合基因,并将其连入腺相关病毒载体PSSHG中,构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关载体并进行酶切鉴定.结果:T-easy/GFP经EcoRⅠ酶切后,可得到730 bp左右的片段,GFP基因经DNA测序证实与GenBank序列一致;pBV220/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到约为 1 000 bp的基因片段;PSSHG /NT4-GFP-Ant经 BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到大小约为1 000 bp长度的基因片段.结论:成功克隆GFP基因,成功构建NT4信号肽-GFP-Ant穿膜肽融合基因和PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体.
