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HIV发病机制的细胞学基础
HIV通过靶细胞上特定受体CD4、CXCR4及CCR5分子,攻击D4+T细胞、树突状细换胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞等免疫细胞,引起细胞病变及清除,并引发受损免疫细胞定位器官相应病理改变.某些器官及细胞成为HIV潜伏期贮库,贮库病毒抗药株的出现及其持续释放成为当今HIV预防、治疗主要障碍.如何使潜伏期贮库病毒完全释放并通过有效方法清除是当今抗HIV研究热点、难点问题.从细胞学水平深入了解HIV发病机制,将为寻求有效防制策略提供理论依据.
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具有抑制肿瘤前景基因-人MCPIP基因的克隆及细胞定位
目的 构建人MCPIP基因的真核表达载体,观察其在人胚肾细胞系(HEK293T)细胞中的表达及其定位特征.方法 佛波酯(PMA)刺激单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,提取细胞mRNA,反转录为cDNA作为模板,扩增MCPIP基因编码区序列,克隆入真核细胞载体中,酶切鉴定目的 基因.将重组质粒转染HEK293T细胞,Western blot检测MCPIP蛋白质表达状况,激光共聚焦显微镜下直接观察基因定位情况.结果 酶切鉴定和测序证明,成功构建MCPIP真核表达载体.Western blot检测表明MCPIP真核表达载体转染293T细胞表达大小约为70kD的蛋白质.激光共聚焦显微镜下直接观察RFP-MCPIP表达可见在293T细胞中主要为细胞质中点状分布.结论 本研究成功构建了MCPIP真核表达载体,检测到MCPIP在巨噬细胞中高表达.并成功证实其细胞质点状定位的特征.
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转sck基因水稻中CpTI蛋白的细胞内定位
目的 转sck基因水稻中CpTI蛋白细胞内定位.方法 运用免疫组织化学方法,应用免疫电镜技术,观察在转sck基因水稻根部细胞、叶片细胞中CpTI蛋白的定位情况.结果 在转sck基因水稻根尖部细胞的内质网中和内质网附近有胶体金颗粒大量存在,细胞的质体、叶绿体、细胞质、细胞核中也散在一些胶体金颗粒,在对照水稻的根部内质网和其他部位未发现胶体金颗粒存在.水稻叶片细胞由于有叶泡的存在,内质网不明显,但是细胞核、细胞质和质体内也发现胶体金颗粒,在非转基因水稻的叶片中未发现胶体金颗粒.结论 转sck基因水稻中的CpTI蛋白在内质网中大量存在,在细胞的质体、叶绿体、细胞质、细胞核中也存在少量CpTI蛋白.
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CPSIT＿0271的定位、表达时相及其诱导THP-1细胞产生促炎症因子
目的：研究鹦鹉热嗜衣原体（ Chlamydophila psittaci，Cps） CPSIT＿0271蛋白的定位和表达时相，及其重组蛋白对人单核细胞（ THP-1）产生促炎症因子的诱生作用。方法原核表达、纯化GST-CPSIT＿0271重组蛋白，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，ELISA分析血清抗体滴度。间接免疫荧光法初步观察内源性CPSIT＿0271的定位，并通过Western blot 分析CPSIT＿0271在Cps感染HeLa细胞8 h、18 h、24 h、36 h和48 h后的表达情况。用不同浓度GST-CPSIT＿0271刺激THP-1细胞，ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平。结果在Cps感染的HeLa细胞中，CPSIT＿0271分布于衣原体包涵体内。 CPSIT＿0271在Cps感染HeLa细胞后36 h开始表达，在48 h时表达量增加。 GST-CPSIT＿0271免疫小鼠，产生较强的免疫应答，小鼠血清特异性抗体效价为1∶16000。当GST-CPSIT＿0271蛋白浓度为2～5μg/ml时，刺激THP-1细胞产生IL-6、IL-1β和TNF-α的水平与CPSIT＿0271呈明显的剂量依赖关系。5μg/ml的GST-CPSIT＿0271蛋白刺激THP-1细胞，TNF-α和IL-1β在24 h时达到高峰，IL-6在48 h时达到高峰。结论 CPSIT＿0271蛋白分布于包涵体内，CPSIT＿0271基因可能为Cps晚期表达基因；GST-CPSIT＿0271具有较好的免疫原性，并能促进THP-1细胞分泌促炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β。
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0271 细胞定位 表达时相 促炎症因子 -
卵圆细胞及其与原发性肝癌关系的研究进展
尽年来,有关干细胞的研究已经得到广泛的注意,肝卵圆细胞(HOC)被认为是肝脏干细胞的子代,是肝脏干细胞到成熟肝细胞的中间体,他既可以向胆管细胞分化,又可向肝细胞分化.目前认为肝卵圆细胞分为三型,Ⅰ型细胞体积较小,核大,胞质少,此为原始的卵圆细胞.Ⅱ型细胞体积稍大,胞质稍多,此为向胆管上皮分化的胆管样卵圆细胞.Ⅲ型细胞体积稍大,内含稍多粗面内质网,此为向肝细胞分化的肝细胞样卵圆细胞.肝卵圆细胞定位于赫氏小管区(Hering管)和胆管树终末处,与骨髓干细胞有大量共同的表面标志,受多种细胞因子的调控,已经在体外分离培养成功,并发现存在于肝癌组织中.肝卵圆细胞"成熟受阻"可能是导致原发性肝癌的原因之一,其向原发性肝癌转化的机制仍不清楚,可能是多个癌基因和/或抑癌基因共同调控的结果.本文就此研究进展作一综述.
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肝细胞中一种高通量二维细胞识别技术方法的建立
目的:建立一种新颖的高通量二维细胞识别、定位技术,为肝癌干细胞的鉴定、异质性分化细胞分类等提供技术平台,方法:收集原发性肝细胞癌患者手术标本1例,每个标本分别石蜡包埋,以1μm的厚度连续切5片,每张切片取第一片做常规HE染色,病理诊断,其余4张切片分别以肝癌组织中目前已报道的8个可能的肝癌干细胞标志物进行了免疫荧光标记,利用试剂Hoechst33342(蓝色)标记细胞核定位,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC),四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate rhodamine)双荧光标记待测抗体,荧光显微镜检测荧光位置及强度.结果:以4个切片中均能识别的细胞核做定位,确定每个切片1个1×100显微镜视野中有效细胞的个数,作出4个切片合并的细胞图谱,建立了一种新颖的二维细胞识别技术.检测得到有效细胞为2 772个.检测的8个抗体均在肝癌细胞中表达,并且不同肝癌细胞中肝癌干细胞标志物的表达情况不同,同一肝癌细胞可同时表达多个肝癌干细胞的分子标志,且可见8个抗体均阳性的肝癌细胞.其中2 772个有效细胞中有2 453个细胞为阴性,所占比例为884.9‰.结论:完成了高通量二维细胞识别、定位技术方法的建立,该方法可在一个肝癌干细胞上检测两种以上的肝癌干细胞分子标志的表达情况.
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胃癌下调新基因CA11的功能研究
目的:胃癌下调新基因CA11的细胞定位及其生物学功能的研究.方法:地高辛标记CA11原位正常胃黏膜组织mRNA杂交.将CA11构建至pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体,将其及空载pcDNA3.1/Myc-His(-)A载体稳定转染胃癌7901细胞系,Western blot证实CA11转染细胞CA11融合蛋白表达,行生长曲线及MTT检测,形态学分析结果.结果:NBT/BCIP显色表明,CA11位于正常胃黏膜上皮细胞胞内,CA11稳定转染胃癌7901细胞系表达CA11融合蛋白,生长曲线及MTT检测均表明,CA11显著抑制胃癌7901细胞的生长(72 h,0.379±0.019 A vs 0.467±0.021 A,P＜0.01).较对照组空载转染7901细胞,CA11稳定转染胃癌7901细胞系形态不规则,核糖体、胞膜纤毛明显减少.结论:CA11位于正常胃黏膜细胞,能显著抑制胃癌细胞的生长,可能为一功能强大的候选抑癌基因.
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HCV NS5A反式激活基因NS5ATP13对肝癌细胞生长的影响
目的 验证HCV NS5A对NS5ATP13基因反式激活作用,并检测NS5ATP13基因因表达产物对Huh-7 细胞系生长的影响.方法 应用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR )方法验证HCV NS5A对NS5ATP13基基因的反式激活作用,构建NS5ATP13与绿色荧光蛋白(GFP )的融合蛋蛋白表达载体,用荧光显微镜观察察NS5ATP13-GFP融合蛋白在细胞的分布.结果 HCV NS5A可反式激活活NS5ATP13基因的表达,NS5A ATP13-GFP融合蛋白荧光主要集中在细胞核质,转染细胞出现大量双核核及多核现象,活细胞发光法检测胞发光法检测测测NS5ATP13 NS5ATP13具有促进细胞增殖的作用..结论 NS5ATP13 基因生物学功能的研究,为HCV致肝纤维化和和肝癌的病理机制研究提供新的思路.
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非小细胞肺癌患者癌组织中一氧化氮合酶表达水平与P53蛋白表达水平的关系
一氧化氮合酶(NOS)有多种亚型,依NOS基因序列和细胞定位不同分为NOSⅠ(主要存在于神经组织中)、NOSⅡ(主要分布于巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞等)、NOSⅢ(主要分布于内皮细胞).NOSⅠ、NOSⅢ是细胞本身所固有的,称为结构型NOS(constitutive NOS, cNOS);NOSⅡ是在病理条件下诱生表达,称为诱生型NOS(inducible NOS, iNOS).
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钙周期素结合蛋白的细胞周期依赖性转位现象
目的 研究钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)在胃癌细胞SGC7901中亚细胞定位与细胞周期的关系.方法 利用双胸腺嘧啶脱氧核苷(胸苷)阻滞法将胃癌细胞SGC7901进行细胞周期同步化,流式细胞术检测细胞周期同步化效果.免疫荧光染色法观察CacyBP/SIP在不同时期的亚细胞定位.蛋白质印迹法检测CacyBP/SIP总蛋白及核蛋白在不同时期的表达水平.结果 采用双胸苷阻滞法使SGC7901细胞阻滞于G1/S期,撤药后培养4h,细胞进入S期.大多数细胞在8～12h时进入G2/M期,16h又重新进入G1期.免疫荧光染色发现,在G1和S期时,CacyBP/SIP主要分布在细胞浆中,而在以G2期为主的细胞中,CacyBP/SIP聚集在核周或进入胞核,说明CacyBP/SIP存在细胞周期依赖性的核转位.在细胞的各时相中CacyBP/SIP总蛋白无明显变化,但在G2期时CacyBP/SIP的核蛋白表达水平增高.结论 CacyBP/SIP存在细胞周期依赖的转位现象,可能参与了G2/M期的调控作用.
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毛囊干细胞定位、提纯和三维培养的研究进展
皮肤作为人体外层的防御系统,具有极强的修复和再生能力.尤其是表皮,由多层角质细胞构成,其基底膜存在着对皮肤再生、损伤修复起决定性作用的干细胞群,称为表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC).
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穿膜肽TAT的表达与活性的初步研究
目的:构建原核表达载体,获得纯化的融合蛋白TAT-GFP,以便于考查TAT的细胞定位及穿膜功能.方法:将TAT基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因串联于原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导融合表达.分离纯化的融合蛋白与BHK-21细胞共孵育一定时间后,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的定位;同时以尾静脉注射方式进行小鼠给药实验,一定时间后麻醉,将主要器官组织取出、固定、冰冻切片,荧光显微镜下观察蛋白的分布情况.结果:DNA测序证明成功构建融合蛋白表达载体pET28a-tat-gfp.经诱导表达、纯化可获得纯度为85%以上的融合蛋白TAT-GFP.细胞实验表明,融合蛋白可迅速透过细胞膜并广泛分布于BHK-21细胞内,其中尤以细胞核内多,而对照组GFP蛋白则不能穿透细胞膜入胞;动物实验中,给药2 h后即可观察到TAT携带GFP到达小鼠的各主要器官和组织,甚至穿透血脑屏障分布于脑组织部分.结论:融合表达的穿膜肽TAT具有一定的携带生物分子(GFP)穿膜功能,本研究为深入了解TAT的性质及其未来应用奠定了一定的基础.
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人前列腺癌相关基因pc-1表达产物在细胞内的定位研究
目的:研究pc-1基因表达产物在细胞内的定位.方法:采用巢式PCR技术,从原始克隆质粒中扩增出可编码蛋白分子的pc-1 cDNA片段,分别将其克隆入含EGFP和MYC标签的真核表达载体中;用脂质体介导法将其转染入人前列腺癌细胞C4-2中;通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦显微镜技术检测pc-1表达产物在细胞内的定位.结果与结论:pc-1表达产物定位于细胞质中,为进一步研究其生理、生化功能奠定了基础.
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休眠脑细胞的激活及重组重建神经系统功能的实验研究
本研究课题分为以下两个子课题:《大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆的实验研究》和《胚胎大鼠神经干细胞体外黑质细胞定向诱导的实验研究》.
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FasL在睾丸细胞的定位
FasL/Fas系统介导的胞外信号凋亡途径是哺乳动物睾丸生殖细胞凋亡的一条主要途径,然而,关于FasL在睾丸细胞中的定位却存在争议.本文对近年来国内外关于FasL 在睾丸中的细胞定位研究进行了综述,为阐明FasL/Fas系统介导生殖细胞凋亡的机制提供资料,对深入理解睾丸中Sertoli细胞和生殖细胞间的调控关系及临床实践具有一定的指导作用.
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Fang-1,一个参与血糖调节的新基因
目的克隆血糖调节相关基因.方法按本室以往建立的方法制备大鼠血糖自动调节模型,以灌输生理盐水为对照;取其骨骼肌,采用差异显示技术(DDRT-PCR),获得差异表达基因片段,经狭缝杂交和Northern杂交分析,排除假阳性片段,确定真正的差异表达序列标签(EST),并以其为探针筛选大鼠骨骼肌cDNA文库;将新基因的全长编码区克隆到pEGFP,瞬时转染L-6TG细胞48 h后,荧光显微镜观察蛋白质在细胞中定位.结果获得一个新的全长cDNA,命名为Fang-1,GenBank收录号为AF399873.Blast软件(NCBI)分析显示Fang-1是人类基因AK001644在大鼠中的同源物,其编码区核苷酸同源性为82%,表明该家族蛋白具有保守性.高浓度葡萄糖刺激大鼠后与对照大鼠相比,Fang-1的表达上调;Fang-1编码的蛋白质在细胞核和细胞质均存在.结论从大鼠骨骼肌中克隆到一个参与血糖调节的新基因,该基因编码蛋白在细胞质和细胞核均存在,并通过其表达上调控制或部分控制某些目前未知的机制而达到调节血糖水平的作用.
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转化生长因子-β在骨质疏松骨折愈合过程中表达的实验研究
骨质疏松(osteoporosis,OP)是一种以骨组织显微结构破坏/骨矿成分和骨基质等比例不断减少,骨质变薄,骨小梁数量减少,导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身代谢障碍性疾病,是老年人的常见病与多发病,尤以绝经期妇女为重.骨质疏松骨折的愈合由于其骨质疏松的特殊性,与正常骨折的愈合又有区别.转化生子因子(TGF)-β是TGF超家族的一部分,现有TGF-β 1～5 5个成员.TGF-β在正常骨折愈合过程中有重要意义,调节细胞的增殖、分化,但在骨质疏松骨折愈合过程中的表达变化研究甚少.本实验通过光镜观察、免疫组织化学,对不同时期骨质疏松性骨折骨痂局部TGF-β基因表达的细胞定位和表达模式进行了研究,这有助于从基因表达水平深入了解骨质疏松骨折愈合的病理生理机制.
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脐带间充质干细胞在颅脑损伤模型鼠体内的迁徙与定位
背景：选择有效的手段，标记和追踪细胞在体内的分布、分化及转归，才能深入探讨细胞发挥治疗效果的具体机制。目的：了解BrdU标记脐带间充质干细胞在颅脑损伤大鼠体内的迁徙和定位情况。方法：分离培养人脐带间充质干细胞并进行细胞表面标志物鉴定，取第3代人脐带间充质干细胞采用 BrdU进行标记，MTT法检测细胞增殖能力。将BrdU标记的人脐带间充质干细胞经尾静脉注射到颅脑损伤模型大鼠体内，移植后14 d取损伤处脑组织制备组织切片，倒置荧光显微镜下观察人脐带间充质干细胞的迁徙和定位情况。结果与结论：经流式细胞仪检测，细胞表达CD29、CD44、CD105，不表达造血细胞表面特异性标志CD34和CD45。通过生长曲线可以发现，细胞在接种1-3 d处于调整期，第3-5天进入对数生长期。移植后14 d在脑损伤部位可以观察到BrdU染色阳性细胞，表明移植的人脐带间充质干细胞在大鼠体内发生迁徙，经过大鼠的外周血液循环迁徙达到颅脑损伤部位，实现对损伤部位的有效修复。
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表皮干细胞的定向分化:隆突激活假说的新认识
0 引言自1990年孙司天等提出毛囊干细胞定位于毛囊的隆突部--立毛肌的附着点处,即隆突激活假说,为表皮干细胞的研究奠定了坚实的理论基础.
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pCDNA3.1-MT2A真核表达载体的构建及亚细胞定位
目的：构建pCDNA3.1-MT2A真核表达载体并观察其在293T和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法：使用基因合成法合成 MT2A 基因，在其 N 端添加 Kozak 序列及 His 标签序列，将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3.1（＋）载体的BamHⅠ和NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后，挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。将鉴定正确的pCDNA3.1-MT2A质粒采用脂质体法转染293T和SMMC7721细胞株，激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况。结果：pCDNA3.1-MT2A重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实，目的基因MT2A的序列完全正确，真核表达载体构建成功，激光共聚焦观察发现该重组质粒表达于293T和SMMC7721细胞的胞质中。结论：成功构建pCDNA3.1-MT2A融合基因并进行真核表达，发现MT2A主要定位于293T和SMMC7721细胞的细胞质中。本研究为探讨MT2A 在肝癌细胞内的功能奠定了基础。
