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CPSIT＿0271的定位、表达时相及其诱导THP-1细胞产生促炎症因子
目的：研究鹦鹉热嗜衣原体（ Chlamydophila psittaci，Cps） CPSIT＿0271蛋白的定位和表达时相，及其重组蛋白对人单核细胞（ THP-1）产生促炎症因子的诱生作用。方法原核表达、纯化GST-CPSIT＿0271重组蛋白，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，ELISA分析血清抗体滴度。间接免疫荧光法初步观察内源性CPSIT＿0271的定位，并通过Western blot 分析CPSIT＿0271在Cps感染HeLa细胞8 h、18 h、24 h、36 h和48 h后的表达情况。用不同浓度GST-CPSIT＿0271刺激THP-1细胞，ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平。结果在Cps感染的HeLa细胞中，CPSIT＿0271分布于衣原体包涵体内。 CPSIT＿0271在Cps感染HeLa细胞后36 h开始表达，在48 h时表达量增加。 GST-CPSIT＿0271免疫小鼠，产生较强的免疫应答，小鼠血清特异性抗体效价为1∶16000。当GST-CPSIT＿0271蛋白浓度为2～5μg/ml时，刺激THP-1细胞产生IL-6、IL-1β和TNF-α的水平与CPSIT＿0271呈明显的剂量依赖关系。5μg/ml的GST-CPSIT＿0271蛋白刺激THP-1细胞，TNF-α和IL-1β在24 h时达到高峰，IL-6在48 h时达到高峰。结论 CPSIT＿0271蛋白分布于包涵体内，CPSIT＿0271基因可能为Cps晚期表达基因；GST-CPSIT＿0271具有较好的免疫原性，并能促进THP-1细胞分泌促炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β。
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0271 细胞定位 表达时相 促炎症因子 -
CPSIT_p7重组表达产物免疫原性检测及其在鹦鹉热嗜衣原体持续性感染中表达的研究
目的：构建鹦鹉热嗜衣原体（ Chlamydophila psittaci，Cps） CPSIT_p7原核表达载体，表达并纯化CPSIT_p7，检测其免疫原性，观察其在持续性感染过程中的mRNA和蛋白动态表达情况。方法原核表达和纯化His-CPSIT_p7融合蛋白，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，ELISA分析His-CPSIT_p7蛋白的免疫原性。采用青霉素与Cps共同处理细胞来制备持续性感染模型， RT-PCR和Western blot检测CPSIT_p7在其持续性感染过程中的表达情况。结果成功构建了pET30a-CPSIT_p7原核表达载体，并表达和纯化较稳定的重组蛋白；该蛋白免疫小鼠40 d后，ELISA 检测血清特异性抗体效价为1∶1000000；RT-PCR和Western blot 结果显示在Cps急性感染与持续性感染过程中CPSIT_p7 mRNA和蛋白表达水平均呈时间依赖性增加，感染后mRNA在36 h表达量达到高峰，之后急性感染呈时间依赖性下降，而持续性感染CPSIT_p7 mRNA高表达水平至少持续到60 h。结论成功克隆表达了His-CPSIT_p7，该蛋白具有较好的免疫原性；CPSIT_p7基因和蛋白在Cps持续性感染中呈高表达。
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鹦鹉热嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白的诊断应用研究
目的 检测鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor,CPAF)免疫优势区基因在E.coli BL21中高效表达的产物在Cps感染诊断中的应用,为建立Cps感染的快速诊断奠定实验基础.方法 利用生物信息学软件筛选出Cps CPAF免疫优势区基因序列(CPAFm,A196～A450),设计特异性引物,PCR扩增目的基因,将其克隆入pGEX6p-2载体后转化E.coli BL21,利用IPTG诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定重组蛋白.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立血清学诊断的间接ELISA法；同时用商品ELISA试剂盒与建立的间接ELISA法检测180份可疑Cps感染的病鸭血清标本,将检测结果进一步用Western blot方法验证.结果 构建原核重组质粒pGEX6p-2/CpsCPAFm,表达相对分子质量约为54×103的目的蛋白产物.以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法检测Cps参考血清,其阴、阳性符合率均为100％；与肺炎嗜农原体(C.pneumoniae,Cpn)、沙眼衣原体(C.trachomatis,Ct)无交叉反应.对180份可疑病鸭血清标本进行检测,与商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒比较,以Western blot方法作对照,自建的ELISA法符合率均为100％,Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率为77.5％～95.0％.结论 以Cps CPAF免疫优势区(A196～A450)作为诊断抗原,建立血清学诊断的间接ELISA法具有较好的临床诊断价值.
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 衣原体蛋白酶样活性因子 免疫活性 血清学诊断 -
鹦鹉热嗜衣原体两对荧光定量PCR引物的应用与比较
针对鹦鹉热嗜衣原体(Cps)的主要外膜蛋白(MOMP)基因和多形态膜蛋白(PMP)基因分别设计引物,建立荧光定量PCR方法,比较两对引物的灵敏度和特异性.试验结果表明,两对引物均可用于Cps检测,在样本中靶标浓度高时,PMP引物的检测灵敏度优于MOMP引物;但前者的扩增效率低于后者,后者更适合用于Cps的实时定量PCR检测.相对定量研究表明国内不同Cps流行株的PMP基因在基因组上的拷贝数可能存在较大差异.
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鹦鹉热嗜衣原体实时定量PCR检测方法的建立
目的 建立一种简便、快速、特异的荧光定量PCR检测方法,用于鹦鹉热嗜衣原体的快速检测.方法 以主要外膜蛋白(MOMP)基因为靶序列设计特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机渗入法建立实时定量PCR检测方法.结果 循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102 -1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.989.该方法用于鹦鹉热嗜衣原体的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍.结论 本研究建立的检测鹦鹉热嗜衣原体的实时定量PCR检测方法具有很高的特异性和敏感性,可以用于鹦鹉热嗜衣原体的检测.
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鹦鹉热嗜衣原体基因组学的研究进展
目前,7株鹦鹉热嗜衣原体全基因组己测序完整,揭示了不同株之间的相同性与差异性.主要外膜蛋白基因、多形态膜蛋白多基因家族、Ⅲ型分泌系统基因和包涵体膜蛋白基因是鹦鹉热嗜表原体(Chlamydophila psittaci,Cps)研究的重点.对多个种株Cps基因组完整核苷酸序列测定的研究,将有助于进一步了解Cps的致病机制,寻找更好的诊断方法和防治措施,预防和控制Cps的流行.
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肺炎嗜衣原体基因组学研究进展
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)于1989年确定的一种严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物,它是重要的人类致病菌,主要引起各种急慢性呼吸系统疾病[1],有报道称Cpn与动脉粥样硬化的发生密切相关.2004年公布的新伯杰氏细菌分类学手册将衣原体科分为衣原体和嗜衣原体两个属,传统的肺炎衣原体称为肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn),与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属[2].目前已完成4株Cpn基因组测序(表1),本文就Cpn基因组结构、功能等作一介绍.
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CPSIT_0942在鹦鹉热嗜衣原体感染细胞中的定位和特性研究
目的 确定假定蛋白CPSIT_0942在鹦鹉热嗜衣原体(Cps)感染细胞中的定位及特征.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增Cps cpsit_0942基因,克隆入pGEX-6p-1原核表达载体,转化至大肠杆菌E.coli BI21,IPTG诱导表达融合蛋白GST-CPSIT_0942,纯化后免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测CPSIT_0942蛋白在细胞内的定位,ELISA检测其在体外诱导THP-1细胞表达炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的情况.结果 CPSIT_0942蛋白能得到可溶性表达蛋白,可诱导机体产生抗体,IFA主要定位于Cps包涵体,该蛋白体外能诱导THP-1细胞产生炎症因子,在4 μg/ml的浓度时,GST-CPSIT_0942诱导产生的IL-1β、IL-6和TNF-α达到大值,且当以4 μg,/ml蛋白刺激细胞12 h时,IL-1β、IL-6和TNF-α达到高峰.结论 CPSIT_0942主要定位于包涵体上,能诱导THP-1细胞产生炎症因子,为阐明衣原体致病机制提供了重要的实验依据.
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 假定蛋白CPSIT_0942 包涵体蛋白 -
鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测
目的 构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps) CPSIT 0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性. 方法 采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_ 0531基因,并构建pET30a-CPSIT_ 0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT_ 0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT_ 0531蛋白的免疫原性. 结果 成功构建了pET30a-CPSIT_ 0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT_ 0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000. 结论 成功克隆表达了His-CPSIT_ 0531,该蛋白具有较好的免疫原性.
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0531 克隆表达 免疫原性 -
鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela细胞中的定位
目的构建鹦鹉热嗜衣原体( Cps) CPSIT_0018原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,观察其在感染的Hela细胞中的定位。方法采用PCR 技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_0018基因,并构建pET30a-CP-SIT_0018原核表达载体,然后转化到宿主菌 E. coli BL21中,IPTG 诱导His-CPSIT_0018融合蛋白表达,进一步用该融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接免疫荧光法分析His-CPSIT_0018蛋白在Hela细胞中的分布特征。结果成功构建了pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白；在Cps感染的Hela细胞中CPSIT_0018的分布与主要外膜蛋白MOMP相似,而与包涵体膜蛋白IncA的分布模式不同。结论成功克隆表达了His-CPSIT_0018,该蛋白定位在Cps包涵体内。
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0018 克隆表达 细胞定位 -
CPSIT_p7通过激活JNK/ERK信号通路诱导宿主细胞炎症
目的 初步探讨鹦鹉热嗜衣原体蛋白CPSIT_p7对宿主细胞炎症反应的调节作用及其分子机制.方法 佛波酯(PMA)处理THP-1细胞过夜,诱导其分化为贴壁的巨噬细胞,之后用CPSIT_p7蛋白刺激贴壁细胞,或先用30 μmol/L ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125和p38抑制剂SB202190分别预处理贴壁细胞,再用CPSIT_p7蛋白处理贴壁细胞;Western blot检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,ELISA检测各种炎症因子的表达水平.结果 0～10 μg/ml CPSIT_p7蛋白刺激PMA诱导的THP-1细胞24 h后,随着CPSIT_p7质量浓度升高,IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的含量呈剂量依赖性增加;10 μg/ml的CPSIT_p7处理细胞0、6、12、24和36 h,在24h时IL-6、IL-8及IL-1β表达水平达到高峰,而TNF-α在12h就达到高峰;CPSIT_p7蛋白处理细胞后其ERK和JNK磷酸化水平显著升高,p38磷酸化水平改变不明显;JNK和ERK抑制剂能明显降低CPSIT_ p7蛋白诱导的IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α表达.结论 CPSIT_ p7通过JNK/MAPKs和ERK/MAPKs信号传导途径诱导THP-1产生IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α炎症因子,与p38/MAPKs信号传导通路无关.
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鹦鹉热嗜衣原体分型的研究进展
鹦鹉热嗜衣原体广泛分布于世界各地,能感染禽鸟、哺乳动物及人类,严重威胁人类健康,并对世界各国的禽类养殖业造成巨大影响.传统的血清学分型法由于其特异性低、敏感性差等缺点几乎已被淘汰,随着分子生物学技术的发展,基因分型法凭借其高特异性、高敏感性、高分辨率等优点,有效地弥补了血清学分型的不足.本文就Cps分型方法的研究进展进行了综述.
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鹦鹉热嗜衣原体检测和诊断方法研究进展
鹦鹉热嗜衣原体(Cps)是一种常见的鸟类、禽类、家畜及人类病原体,快速、准确的确定病原体是控制疾病的关键.本文综述了Cps检测和诊断方法的研究进展,这些方法包括抗原检测、抗体检测和核酸检测等.
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鹦鹉热嗜衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)原核表达与纯化
应用分子生物学技术,选择鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,C.psittaci,Cps)6BC株的CPAF蛋白的免疫优势区基因,进行构建pGEX6p-2/CPAFm重组质粒与重组菌,使用IPTG诱导重组蛋白的表达并分析诱导温度、诱导剂剂量及诱导时间对蛋白表达的影响.重组蛋白以GST琼脂糖凝胶FF进行纯化,用SDS - PAGE和免疫印迹( Western blot)进行鉴定.为建立Cps的快速诊断和富集Cps诊断抗原奠定良好的试验基础.
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鹦鹉热衣原体CPSIT_0580蛋白的克隆表达
目的:CPSIT_0580蛋白的克隆表达,为进一步研究其结构与功能奠定基础.方法:构建重组质粒pGEX-6P-1/CPSIT_0580,经PCR、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli BL21中.结果:构建了重组质粒pGEX-6P-1/CPSIT_0580,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为28kDa的GST-CPSIT_0580目的蛋白,表达了相对分子量(Mr)与预测分子量相近的可溶性蛋白.重组蛋白经GST树脂成功纯化.结论:成功克隆表达了CPSIT_0580蛋白,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.
