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肺炎嗜衣原体菌体抗原的制备及应用
目的 制备肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)菌体抗原,纯化后建立ELISA方法,用于血清Cpn抗体的检测. 方法 应用进口Cpn毒株感染Hep-2细胞,利用吖啶橙染色和直接免疫荧光染色判断Cpn感染细胞,制备Cpn抗原.用初步纯化的Cpn抗原建立ELISA方法检测人血清特异性抗体. 结果 吖啶橙染色和直接免疫荧光检测显示,Cpn成功感染Hep-2细胞.提取Cpn抗原,用ELISA检测84份病人血清特异抗体,阳性率为52.4%,ELISA试剂盒法的阳性率为51.2%,差异无统计学意义(P＞0.05).用Cpn菌体抗原ELISA检测209份病人血清,阳性率59.3%(其中心血管疾病患者血清138份,阳性率58.0%;呼吸系统疾病患者血清71份,阳性率62.0%);检测84份健康者血清,阳性率2.4%,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Cpn菌体抗原ELISA检测血清抗Cpn抗体可用于判断Cpn感染;病人血清Cpn抗体阳性表明,某些心血管和呼吸系统疾病患者的致病原因可能与肺炎嗜衣原体感染有关.
关键词： 肺炎嗜衣原体 吖啶橙染色 直接免疫荧光染色法 Cpn菌体抗原ELISA -
肺炎嗜衣原体CPAF诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡
目的 研究肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor,CPAF)能否在体外诱导人单核细胞THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,为进一步探索Cpn感染宿主致病的分子机制提供实验依据.方法 将Cpn CPAF全基因克隆于pGEX6p-2载体上,在大肠杆菌(E coli)中诱导表达重组蛋白,经去内毒素纯化柱和琼脂糖凝胶FF获得纯化且无脂多糖(LPS)污染的重组蛋白GST-CPAF.以不同浓度的该蛋白作用于THP-1,ELISA检测TNF-α吨和IL-6水平.MTT法检测经该蛋白处理后THP-1的增生或抑制作用,用Hoechst33258荧光染色、DNA片段化分析、Armexin V-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况.结果 制备的莺组蛋白GST-CPAF以时间和剂量依赖方式刺激THP-1分泌TNF-α和IL-6,并以剂量依赖方式抑制THP-1增殖;当GST-CPAF刺激THP-1细胞24 h后,能诱导细胞调亡.结论 制备的Cpn重组蛋白GST-CPAF能诱导THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,可能是Cpn致病机制中的一个因素.
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肺炎嗜衣原体热休克蛋白10经TLR2及TLR4调控THP-1分泌TNF-α
目的 探讨肺炎嗜衣原体(Cpn)热休克蛋白10(HSP10)诱导人单核细胞分泌炎症因子的作用及Toll样受体(TLR)2、TLR4与此作用的相关性.方法 制备Cpn HSP10(CHSP10)纯化蛋白,去内毒素活性后用不同浓度(0.5、1、5、10、20、30μ/ml)刺激THP-1细胞0、6、12、24、36、48、60 h,并比较蛋白不同处理组别中TNF-α的水平差异；以间接免疫荧光及RT-PCR鉴定THP-1细胞上的TLR4及TLR2；分离C3H系野生型和TLR4缺陷型小鼠巨噬细胞,以CHSP10刺激后检测TNF-α水平；用抗TLR2/TLR4单克隆抗体预孵育细胞,ELISA检测CHSP10刺激细胞前后TNF-α的变化.结果 CHSP10刺激THP-1细胞引起上清液炎症因子TNF-α水平显著增加,经加热等处理后蛋白诱生TNF-α的作用明显降低.THP-1细胞可检测到TLR2及TLR4的mRNA及蛋白表达,CHSP10诱生C3H系野生型小鼠细胞分泌的TNF-α明显高于TLR4缺陷型小鼠细胞,TLR2/4经单克隆抗体作用后均可显著降低CHSP10诱导THP-1分泌TNF-α的水平.结论 CHSP10可能作为炎症相关蛋白参与了Cpn对宿主细胞的致炎作用；并且TLR2及TLR4在该炎症刺激信号的传递过程中发挥一定的作用.
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肺炎嗜衣原体、IL-6与冠心病关系的血清学探讨
目的 从血清学的角度分析肺炎嗜衣原体、IL-6与冠心病的关系.方法 选择我院2014年9月～2015年7月收治的冠心病患者72例作为研究对象,按世界卫生组织提出的冠心病分型标准将其分为稳定组43例和非稳定组29例,选择同期在我院进行体检的健康者60名作为对照组,分析肺炎嗜衣原体、IL-6与冠心病的关系.结果 冠心病患者血清IgA的阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);冠心病患者血清IgG、IgM的阳性率与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);非稳定组和稳定组患者血清IL-6水平均比对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肺炎嗜衣原体、IL-6与冠心病存在紧密联系,二者均参与了冠心病的发生和发展过程.
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肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的表达与临床应用
目的 探讨肺炎嗜衣原体(CPN)蛋白酶样活性因子(CPAF)重组蛋白在CPN感染实验室诊断中的应用价值.方法 构建CPAF免疫优势区基因重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,分析其抗原特异性;间接 ELISA法检测CPN参考血清、临床血清标本中的特异性IgM和IgG抗体.以及沙眼衣原体(Ct)阳性血清.结果 高效表达和有效纯化出一相对分子质量(Mr)约为5.13×10~3的特异性重组蛋白;间接ELISA法测定用其免疫兔血清中的特异性IgG和IgM抗体效价,分别高达1:16 000和1:8 000;检测Cpn IgM和IgG参考血清,阴性和阳性结果符合率均为100.0%;与"金标准"方法MIF比较,检测300份呼吸道感染患者抗血清,IgM、IgG符合率分别为98.3%、99.0%;检测Ct阳性参考血清和阳性临床血清标本,无阳性结果.结论 表达的CPN CPAF免疫优势区重组蛋白具有良好的抗原性,在CPN感染的实验室诊断中具有较高的应用价值.
关键词： 肺炎嗜衣原体 衣原体蛋白酶样活性因子 重组蛋白 实验室诊断 -
衣原体肺炎患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6及IL-10的检测及临床意义
目的 探讨肺炎嗜衣原体患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α,IL-6和IL-10的产生情况及临床意义.方法 获取肺炎嗜衣原体感染急性患者为研究对象,获取支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测其TNF-α,IL-6和IL-10的含量,同时选取同期恢复期患者作为对照.结果 衣原体急性期患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10显著高于正常对照组.在恢复期内,TNF-α和IL-6明显低于急性期,但IL-10依然维持在较高水平.结论 肺炎嗜衣原体感染患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α,IL-6和IL-10显著增高,可能与肺炎嗜衣原体的发病有关.
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急性毛细支气管炎儿童非典型细菌感染分析
目的 探讨急性毛细支气管炎婴幼儿下呼吸道非典型细菌肺炎支原体、肺炎嗜衣原体及沙眼衣原体的感染情况.方法 获取1～24月婴幼儿的鼻咽分泌物,利用多重PCR检测鼻咽分泌物中的肺炎支原体和肺炎嗜衣原体,并用限制性内切酶片段长度多态性分析沙眼衣原体的感染情况.结果 在所获得的120例急性毛细支气管炎婴幼儿标本中,共检测出阳性标本28例(23.3%),其中以肺炎支原体常见(12/120,10%),肺炎嗜衣原体4例,沙眼衣原体4例.混合感染8例,其中5例为肺炎支原体合并肺炎嗜衣原体感染,2例为肺炎嗜衣原体合并沙眼衣原体感染,1例合并有3种感染.感染患儿年龄大部分分布于6～12月之间(50例).此外,在这个年龄组所有感染病例中,6例为肺炎支原体感染,4例为肺炎嗜衣原体感染.结论 在急性毛细支气管炎婴幼儿中,这些非典型细菌可能是重要的感染因子,可诱导严重的急性毛细支气管炎.
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肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建
目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因,构建pGEX-6p-2/Pmp21原核表达载体.方法 筛选Pmp21优势抗原表位,PCR法扩增Pmp21目的 基因;并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体;经PCR与测序鉴定.结果 软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列,设计引物PCR法扩增得到目的 片段;构建重组质粒经测序鉴定,BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致.结论 成功构建pGEX-6p-2/Pmp21载体,为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础.
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肺炎嗜衣原体三种不同抗原的临床诊断价值分析
目的 探讨分析肺炎嗜衣原体三种不同抗原在肺炎嗜衣原体感染血清学中的临床诊断价值.方法 选取2008年1月～2011年1月笔者所在医院188例经检测确诊为呼吸道感染的患者的血清标本,分别采取间接免疫印迹法(Western-blot)和ELISA法对其免疫反应和免疫原性进行分析,对比不同方法检出阳性率和准确率.结果 ELISA法对三种不同抗原的准确性分别为92.6%(174/188)、94.7%(178/188)、96.8%(182/188).Cpn0146组的阳性率为38.8%(73/188),对比肺炎嗜衣原体的IgG试剂盒检出的阳性率,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);Cpn0147的阳性率41.0%(77/188),对比肺炎嗜衣原体的IgG试剂盒检出的阳性率,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);Cpn0308的阳性率41.5%(78/188),对比肺炎嗜衣原体的IgG试剂盒检出的阳性率,二者比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 三种不同抗原中,以Cpn0308在肺炎嗜衣原体感染血清学的诊断实验中的检出准确率与阳性率高,对临床诊断肺炎嗜衣原体有良好的应用价值,值得研究利用.
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呼吸道感染患者外周血中肺炎嗜衣原体的检测与分析
目的 检测并分析呼吸道疾病患者的肺炎嗜衣原体(Cpn)感染率.方法 收集173例呼吸道感染患者和52例健康体检者外周血标本,分离外周血单核细胞(PBMC)血清.提取纯化PBMC的DNA,以该DNA为模板,用特异性引物体外扩增Cpn MOMP基因.扩增产物经电泳及测序鉴定,确认为Cpn特异性的目的 基因.用ELISA法检测待测血清中的Cpn-IgG抗体.通过PCR与ELISA的检测结果,结合临床资料进行流行病学综合分析Cpn感染率.结果 以PBMC基因组DNA为模板,呼吸道感染组患者标本中Cpn MOMP阳性率为32.40%(56/173),健康对照组中阳性率为9.62 oA(5/52);经测序比对,所有MOMP阳性扩增产物与Cpn AR-39的MOMP基因同源性在99%以上.ELISA检测血清Cpn-IgG,感染组阳性率50.87%(88/173),对照组阳性率为30.77%(16/52),两组差异有统计学意义.比较不同年龄组ELISA及MOMP PCR两种方法 检测Cpn感染指标的阳性率,发现老年人的Cpn感染率高.结论 在呼吸道感染患者不同年龄阶段均检出较高的Cpn感染指标,其中老年人群中检出率高,说明Cpn是本地区呼吸道感染常见的病原体之一.
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肺炎嗜衣原体临床株的分离鉴定与小鼠接种的初步观察
目的 从临床标本中分离培养肺炎嗜衣原体,接种小鼠后对其进行初步观察. 方法采用细胞培养法从临床标本中分离培养肺炎嗜衣原体;结合吉姆萨染色、间接免疫荧光、16SrDNA序列同源性和系统发育分析对其进行鉴定;建立动物模型对其毒力进行初步研究.结果 从临床标本中分离的菌株NH001和NH002被鉴定为肺炎嗜衣原体,攻击小鼠后均产生明显肺部病理改变.结论 成功分离培养出两株毒力较强的肺炎嗜衣原体菌株,为肺炎嗜衣原体相关研究提供了优质菌源.
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肺炎嗜衣原体Cpn0797蛋白的生物信息学分析及其单克隆抗体制备鉴定
目的 生物信息学分析肺炎嗜衣原体Cpn0797蛋白的结构,制备特异性的抗Cpn0797蛋白的单克隆抗体.方法 用ProtParam、SignalP、NPS@、和PSORT等软件对Cpn0797蛋白的理化参数、信号肽、二级结构、蛋白亚细胞定位进行分析;原核表达纯化GST-Cpn0797融合蛋白,以其为免疫原免疫BALB/c小鼠.杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用间接免疫荧光法鉴定单克隆抗体的亚类和特异性.结果 生物信息学分析表明Cpn0797蛋白二级结构以无规则卷曲为主;成功地建立了能稳定分泌抗Cpn0797蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体能特异性的识别Cpn0797内源性蛋白.结论成功制备特异性的Cpn0797单克隆抗体,为进一步探究Cpn0797蛋白的生物学功能提供实验基础.
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肺炎嗜衣原体Cpn0425重组蛋白的克隆与表达及抗原性研究
目的 构建重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中进行诱导表达,纯化获得重组融合蛋白Cpn0425,并评价其抗原性.方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,测序正确后在E.coli BL21中诱导表达,用SDS-PAGE和 Western-Blot 进行分析和鉴定.结果 构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为50kDa的GST-Cpn0425目的 蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的 蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,经采用默克Novagen的GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白.结论 获得了Cpn0425基因片段,并在E.coli BL21中成功表达,GST-Cpn0425具有良好的抗原性.
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肺炎嗜衣原体MOMP和人IL-2融合基因DNA疫苗的免疫原性研究
目的 构建肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(MOMP)单基因及momp和人IL-2融合基因的真核表达载体并比较其免疫反应性,为研制Cpn核酸疫苗提供理论和实验依据. 方法 扩增Cpn momp及人IL-2基因并将二者融合,将momp和momp-IL-2分别克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体;制备纳米粒DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,免疫荧光组化法检测重组质粒在小鼠组织内的稳定表达;ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体和小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ水平;MTT法测定脾淋巴细胞特异性增殖反应. 结果 成功制备了pcDNA3.1(+)-momp和pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的纳米核酸疫苗;Cpn momp单基因和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生特异性抗体,且pcDNA3.1(+)-momp-IL-2能诱导小鼠产生更高效价的特异性抗体(P<0.05);pcDNA3.1(+)-momp-IL-2诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ的量及对特异抗原的刺激指数明显高于pcDNA3.1(+)-momp.结论 Cpn momp单基因核酸疫苗和momp-IL-2融合基因核酸疫苗均能刺激小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答;pcDNA3.1(+)-momp-IL-2的免疫效果强于pcDNA3.1(+)-momp.
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衣原体持续性感染机制的研究进展
人类致病性衣原体主要有肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct).其中Cpn是引起人类急性呼吸道感染的重要病原菌,可引起多种呼吸系统感染性疾病,如新生儿肺炎、支气管炎、咽炎等,同时Cpn与冠状动脉粥样硬化等心血管疾病密切相关.近Shima[1]等报道,Cpn感染与老年痴呆症的发病机理有关.Ct不仅引起沙眼, 也是性传播性疾病( sextransmitted disease, STD)常见的病原体之一.
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肺炎嗜衣原体基因组学研究进展
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)于1989年确定的一种严格真核细胞内寄生的原核细胞型微生物,它是重要的人类致病菌,主要引起各种急慢性呼吸系统疾病[1],有报道称Cpn与动脉粥样硬化的发生密切相关.2004年公布的新伯杰氏细菌分类学手册将衣原体科分为衣原体和嗜衣原体两个属,传统的肺炎衣原体称为肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn),与鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体、豚鼠嗜衣原体、猫嗜衣原体、兽类嗜衣原体共同组成嗜衣原体属[2].目前已完成4株Cpn基因组测序(表1),本文就Cpn基因组结构、功能等作一介绍.
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肺炎嗜衣原体感染与动脉粥样硬化的关系
本文介绍了肺炎嗜衣原体感染与动脉粥样硬化的关系、肺炎嗜衣原体在体内的传播及其与血管内皮细胞、单核/巨噬细胞、平滑肌细胞之间的相互作用,以及肺炎嗜衣原体感染对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响和肺炎嗜衣原体感染致动脉粥样硬化的机制.
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肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147诱导单核细胞分泌TNF-α和IL-8
目的：探讨肺炎嗜衣原体( Cpn)包涵体膜蛋白Cpn0147诱导人单核细胞分泌炎症因子的分子机制。方法用去除内毒素活性的不同浓度Cpn0147重组蛋白(1.0、10.0、30.0和50.0μg/mL)刺激THP-1细胞0~48 h,ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-8(IL-8)的分泌水平；实时定量PCR检测TNF-α和IL-8 mRNA的表达；用Toll样受体2( TLR2)和TLR4中和抗体处理THP-1细胞,或采用 TLR2和 TLR4 siRNA沉默其表达, ELISA检测THP-1处理前后TNF-α和IL-8分泌的变化。结果 Cpn0147可诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-8的mRNA和蛋白；同时,不同时间点Cpn0147对TNF-α和IL-8的诱导水平有所不同,Cpn0147作用2~6 h后即可诱导TNF-α和IL-8分泌,12 h时达到峰值,随后逐渐下降。采用TLR2和TLR4中和抗体封闭THP-1细胞后,TNF-α和IL-8分泌水平明显减少,采用TLR2和TLR4 siRNA干扰其表达后,TNF-α和IL-8的分泌也得到了类似的结果。结论 Cpn0147可能通过TLR2和TLR4介导TNF-α和IL-8分泌。
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人咽拭子中肺炎嗜衣原体基因型的初步鉴定
目的 了解中国咽部感染患者肺炎嗜衣原体(Cpn)的基因型.方法 从中国不同城市收集疑为Cpn感染患者的咽拭子标本465份,巢式PCR扩增Cpn主要外膜蛋白基因(ompA)片段,其中包括4个变异区,对所得58份阳性标本进行ompA基因序列测序,对照Cpn参考株基因,根据同源性对这些临床株基因进行分型.结果 从58份Cpn临床株标本中,检出CpnA、CpnB、CpnC、CpnD共4种基因型,14个基因变体,其中以C型为常见(89.7%),其次依次为A型(5.2%)、B型(3.4%)、D型(1.7%).结论在中国部分城市,Cpn存在CpnA、CpnB、CpnC、CpnD等4个基因型,其中以C型为常见,呈现较大的多态性,可为其疫苗的研制提供重要的实验依据.
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肺炎嗜衣原体CPAF原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达
目的 对肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)基因进行原核表达,为肺炎嗜衣原体的诊断及疫苗研究奠定基础. 方法 利用PCR技术从肺炎嗜衣原体标准株AR-39中扩增CPAF基因,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达载体.并用双酶切、PCR及序列测定等方法进行鉴定后,在大肠杆菌中诱导表达GST融合蛋白. 结果 重组质粒中CPAF基因序列与肺炎嗜衣原体AR-39的同源性达到100％,CPAF在大肠杆菌中表达高效的GsT融合蛋白. 结论 成功构建肺炎嗜衣原体CPAF基因的原核表达系统,并成功表达重组蛋白,为肺炎嗜衣原体疫苗的研究和临床检测试剂盒的研制打下基础.
