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梅毒螺旋体Hsp10蛋白的原核表达与纯化
目的 原核表达及纯化梅毒螺旋体(Treponema palludim,Tp)热休克蛋白10(Heat shock protein 10,Hsp10).方法 利用Clustal Omega软件对Tp与其他物种的Hsp10蛋白进行多序列比对并运用生物信息学方法分析Hsp10蛋白亲水性和结构.设计特异性引物,以Tp基因组为模板,PCR扩增Hsp10基因.回收PCR产物并用EcoRI和HindⅢ双酶切,酶切片段与同样酶切的质粒pET28a相连,构建表达重组质粒pET28a-Hsp10,转化大肠埃希菌BL21(DE3),采用IPTG诱导重组Hsp10蛋白表达,用镍离子柱纯化目的蛋白. 结果 TpHsp10基因编码蛋白是一个亲水性蛋白,α-螺旋、无规卷曲和β片层分别占5.7％、47.7％和45.4％,三级结构与结核分枝杆菌Hsp10 (PDB:1p3h.1.C)类似,可由7个Hsp10组成一个圆形结构.PCR扩增获得的Hsp10基因全长为267 bp,连接到表达载体pET28a得到重组质粒pET28a-Hsp10,编码含His标签的重组Hsp10蛋白.重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达分子质量单位为13.7 ku的重组Tp Hsp10蛋白,与理论值相符.重组蛋白经镍离子柱层析纯化,获得单一条带的Hsp10. 结论 成功构建重组质粒pET28a-Hsp10并表达和纯化获得Hsp10蛋白,为研究其功能奠定了基础.
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肺炎嗜衣原体热休克蛋白10经TLR2及TLR4调控THP-1分泌TNF-α
目的 探讨肺炎嗜衣原体(Cpn)热休克蛋白10(HSP10)诱导人单核细胞分泌炎症因子的作用及Toll样受体(TLR)2、TLR4与此作用的相关性.方法 制备Cpn HSP10(CHSP10)纯化蛋白,去内毒素活性后用不同浓度(0.5、1、5、10、20、30μ/ml)刺激THP-1细胞0、6、12、24、36、48、60 h,并比较蛋白不同处理组别中TNF-α的水平差异；以间接免疫荧光及RT-PCR鉴定THP-1细胞上的TLR4及TLR2；分离C3H系野生型和TLR4缺陷型小鼠巨噬细胞,以CHSP10刺激后检测TNF-α水平；用抗TLR2/TLR4单克隆抗体预孵育细胞,ELISA检测CHSP10刺激细胞前后TNF-α的变化.结果 CHSP10刺激THP-1细胞引起上清液炎症因子TNF-α水平显著增加,经加热等处理后蛋白诱生TNF-α的作用明显降低.THP-1细胞可检测到TLR2及TLR4的mRNA及蛋白表达,CHSP10诱生C3H系野生型小鼠细胞分泌的TNF-α明显高于TLR4缺陷型小鼠细胞,TLR2/4经单克隆抗体作用后均可显著降低CHSP10诱导THP-1分泌TNF-α的水平.结论 CHSP10可能作为炎症相关蛋白参与了Cpn对宿主细胞的致炎作用；并且TLR2及TLR4在该炎症刺激信号的传递过程中发挥一定的作用.
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肺炎衣原体热休克蛋白10的表达及对炎症因子的诱生作用
目的 在大肠杆菌中表达肺炎衣原体(Cpn)热休克蛋白10(Hsp10),并观察该蛋白诱生巨噬细胞(MΦ)分泌TNF-α和IL-6等促炎因子的作用.方法 将Hsp10基因克隆于pQE30载体,在大肠杆菌(E.coli)M15中表达重组蛋白rHsp10,经亲和层析获得纯化rHsp10.以不同浓度的rHsp10作用于小鼠MΦRAW264.7,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子TNF-α和IL-6.结果 成功构建了pQE30/Hsp10基因,并在大肠杆菌M15中得到高效表达,该蛋白能诱导小鼠MΦ以时间、剂量依赖方式分泌TNF-α和IL-6.结论 表达并纯化的rHsp10蛋白能诱导MΦ分泌TNF-α和IL-6等促炎因子.
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热休克蛋白10在大肠癌的表达及其临床病理意义
目的 研究热休克蛋白10(heat shock protein 10,HSP10)在大肠癌发生、发展过程中的表达规律,了解其与大肠癌临床病理特征和术后生存期的关系.方法 应用免疫组化EnVision二步法,检测HSP10在大肠正常黏膜、腺瘤和腺癌中的表达,及其与临床病理表现和术后生存期的相关性.结果 HSP10在大肠正常黏膜、腺瘤和腺癌中均有表达,在腺瘤、腺癌中的表达明显强于正常黏膜(P＜0.001);HSP10的阳性表达与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤浸润深度、局部淋巴结转移、远处转移、临床分期、组织学分化程度等临床病理特征和术后生存期均无关.结论 HSP10在大肠腺瘤和腺癌的高表达,提示可能与大肠癌的发生发展有关;HSP10的阳性表达与大肠癌的临床病理特征和术后生存期无关.
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HSP10在胃腺癌中的表达及其临床意义
目的 研究HSP10在胃腺癌中的表达及潜在的临床意义.方法 利用RT-PCR方法检测HSP10在胃黏膜细胞和腺癌细胞中的表达差异,采用免疫组织化学染色方法检测HSP10在215例胃腺癌及癌旁组织的表达差异,分析HSP10表达与临床数据的相关性.结果 HSP10在胃腺癌细胞中表达水平明显高于胃黏膜细胞(P＜0.05),在癌组织中表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.05).HSP10表达水平与Bormann分型、肿瘤大小、肿瘤分化程度、Lauren分型、脉管浸润、神经侵犯、TNM分期密切相关(P＜0.05).HSP10表达与胃腺癌的无病生存时间、总生存时间密切相关,HSP10表达水平越高,患者的无病生存时间和总生存时间越短(P＜0.05).结论 HSP10在胃腺癌发生发展中起重要作用,是胃腺癌预后的判断指标.
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沙眼衣原体热休克蛋白10的克隆和序列分析
目的:从临床分泌物标本中获得沙眼衣原体热休克蛋白(cHSP)10基因.方法:用cHSP10特异性引物从20例金标法阳性的临床分泌物样本中扩增cHSP10基因,并经测序证实.结果:从20例金标法阳性标本中的1例扩增出cHSP10基因全长片段,开读框架为306bp,编码102个氨基酸,第194位核苷酸的改变导致氨基酸发生相应改变.结论:从金标法阳性的临床分泌物标本中可以克隆出cHSP10,这为进一步构建重组cHSP10的表达质粒打下了基础.
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雄激素诱导小鼠颗粒细胞凋亡及其机制探讨
目的 通过睾酮诱导小鼠颗粒细胞凋亡,观察热休克蛋白(HSP) 10在高雄激素下的表达,探讨HSP10在高雄激素诱导颗粒细胞凋亡中的作用.方法 原代培养小鼠颗粒细胞,用0、10-8M、10-6M、10-5M睾酮处理24 h,检测HSP10基因表达；处理48 h,检测细胞活力及活性Caspase-3的表达.用AdCMV-H1-siRNA/HSP10腺病毒在小鼠颗粒细胞中干涉HSP10的表达,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,并检测Ki67、Bcl-2、Bax基因水平变化.结果 与0M睾酮处理组比较,10-6 M、10-5M睾酮处理组颗粒细胞的细胞活力降低,且Caspase-3表达增加,HSP10表达降低(P＜0.05)；感染AdCMV-H1-siRNA/HSP10腺病毒后,颗粒细胞的细胞活力降低,且细胞增殖阻滞在G2期,Bcl-2、Ki67表达降低而Bax表达增加(P＜0.05).结论 高雄激素可诱导小鼠颗粒细胞凋亡.其可能的机制是睾酮能降低HSP10表达,经由降低Bcl-2和增加Bax表达的通路.
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HSP60在人视网膜母细胞瘤中表达的研究
目的 研究热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)在未接受治疗的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)患者的视网膜内原发肿瘤细胞和脉络膜、视神经等侵袭部位的肿瘤细胞中的表达,初步分析HSP60在眼球不同部位Rb细胞的表达特点及其可能与Rb细胞凋亡的关系.方法 收集22例(22眼)未接受治疗的Rb患者所摘除眼球的石蜡切片.用免疫组织化学方法测定HSP60、HSP10和Caspase 3在视网膜内和脉络膜、视神经等侵袭部位的表达.结果 22例患者手术后病理检查眼内均见肿瘤细胞.侵袭部位见肿瘤细胞的患者21例,其中肿瘤单独侵犯视神经7例(33.3％),肿瘤单独侵犯脉络膜5例(23.8％),肿瘤同时侵犯视神经和脉络膜9例(42.9％).脉络膜与视神经部位肿瘤细胞HSP60、HSP10的表达均比眼内肿瘤细胞高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).脉络膜与视神经部位肿瘤细胞Caspase 3的表达比眼内肿瘤细胞低,差异均有统计学意义(均为P=0.000).结论 Rb肿瘤细胞在从视网膜内向外侵袭的过程中,可能通过升高HSP60、降低Caspase 3来促进侵袭部位肿瘤细胞的存活.但是HSP60在侵袭部位的升高是肿瘤细胞向外侵袭的原因还是结果,以及是否会进一步增强肿瘤细胞向远处转移等还需进一步研究.
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热休克蛋白10和热休克蛋白60的表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合
目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用.方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离纯化后,体外分别与纯化TFAM共育,抗-TFAM抗体免疫沉淀,SDSPAGE分离蛋白,CBB探测分析.结果:Hsp10可在体外与TFAM发生免疫共沉淀,Hsp60不能.结论:Hsp10可能为TFAM-复合体组分.
关键词： 热休克蛋白10 热休克蛋白60 分离与提纯 线粒体DNA转录因子A -
丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤后HSP10表达的影响
目的 研究丁苯酞干预对大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时点脑组织中热休克蛋白10 (HSP10)表达的影响,并探讨丁苯酞对缺血性脑血管病保护作用的机制.方法 采用夹闭双侧颈总动脉的方法制作大鼠前脑缺血再灌注模型;H＆E染色和NSE免疫组化染色神经元,观察脑组织的形态变化和记数各组神经元数目;免疫组织化学检测对照组、缺血再灌注组及丁苯酞干预组大鼠脑组织HSP10的表达水平变化.结果 脑缺血再灌注后丁苯酞干预组及缺血再灌注组HSP10表达水平于再灌注后6h开始上调,3 d达到高峰,丁苯酞干预组各时间点HSP10阳性表达指数均高于缺血再灌注组,丁苯酞干预组脑组织的损伤程度明显轻于脑缺血再灌注组(P＜0.05).结论 丁苯酞可能通过上调大鼠缺血再灌注损伤后脑组织HSP10的表达,从而抑制前脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡,减少神经元死亡,减轻缺血再灌注后脑组织的损伤.
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大鼠脑缺血再灌注脑组织中HSP10蛋白表达的研究
目的 研究大鼠脑缺血再灌注后,不同时点中前脑皮质、海马区热休克蛋白10(HSP10)的表达变化并探讨其在脑缺血再灌注后脑组织中可能的作用.方法 采用夹闭双侧颈总动脉的方法制作大鼠全脑缺血再灌注模型,免疫组织化学检测模型组、对照组大鼠前脑皮质、海马HSP10的表达变化.结果 脑缺血再灌注后,HSP10在前脑及海马区都有表达;表达于再灌注后6 h开始上调,3 d达到高峰,到7 d仍有较高表达.结论 大鼠脑缺血再灌注后前脑皮质、海马区HSP10表达上调.HSP10的上调可能是脑组织缺血后的一种自身保护性反应.
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血清结核杆菌Hsp10检测在脊柱结核辅助诊断中的价值
目的 检测静脉血中结核杆菌热休克蛋白10(MTB Hsp10)含量,评价MTB Hsp10在脊柱结核感染辅助诊断中的价值.方法 选取2016年2月到2017年3月在新疆维吾尔自治区人民医院脊柱外科疑似脊柱结核患者58例,根据临床及病理学诊断终确诊分为脊柱结核组(n=30),非脊柱结核组(n=28),另外选取30名健康志愿者.采用酶联免疫吸附试验技术(ELISA)检测所有纳入对象静脉血中MTB Hsp10含量,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线,选取约登指数大时的界值作为诊断界值,患者同时接受病灶病理学检查、T-SPOT. TB,所有纳入对象均行结核菌素(PPD)皮肤试验,比较不同检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,分析不同检测结果的一致性.结果 脊柱结核组(n=30)中有27人接受病理学检查;脊柱结核组(n=30)和非脊柱结核组(n=58)血清MTB Hsp10分别是(121.52±24.62)pg/mL和(90.83 ±22.69)pg/mL,差异有统计学意义(P＜0.001),MTB Hsp10检测在脊柱结核诊断中的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为76.7％、77.6％、63.8％和86.5％;PPD皮肤试验的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为66.7％、43.1％、37.7％和71.4％.在脊柱结核患者中,MTB Hsp10的阳性率高于PPD皮肤试验(76.7％比66.7％,P=0.001);与T-SPOT. TB检查比较差异无统计学意义(76.7％比86.7％,P=0.120);与病理学检查比较差异无统计学意义(76.7％ 比85.2％,P=0.092).MTB Hsp10与病理学检查具有一致性(κ=0.413,P=0.032).结论 MTB Hsp10在人体静脉血中是可测的,对于脊柱结核的辅助诊断具有良好的敏感度和特异度,尤其对于脊柱结核快速诊断具有一定意义.
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热休克蛋白10在子宫内膜癌中的表达及意义
目的 探讨热休克蛋白10(HSP10)在子宫内膜癌中的表达及意义.方法 采用免疫组化Envision法检测30例正常子宫内膜、30例增生过长子宫内膜、15例非典型增生子宫内膜、50例子宫内膜癌中HSP10的分布及表达.结果 HSP10在正常子宫内膜、增生过长子宫内膜、非典型增生子宫内膜和子宫内膜癌阳性表达率分别为16.67%(5/30)、43.33%(13/30)、66.67%(10/15)、100.00%(50/50),差异有统计学意义(P<0.001);HSP10的阳性表达程度与子宫内膜癌的肌层浸润深度、宫颈受累情况有关(P<0.05),与手术病理分期、病理分级、组织学类型、腹腔积液细胞学、淋巴结转移无关(P>0.05).结论 HSP10在子宫内膜癌的发生、发展中可能起着重要作用.
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热休克蛋白10在大肠癌发生发展中的表达及其意义
目的了解热休克蛋白10(HSP10)在正常大肠粘膜、腺瘤和腺癌中的表达,并探讨其与大肠癌发生发展的关系.方法应用免疫组化Envision二步法,观察HSP10在正常大肠粘膜、腺瘤和腺癌中的表达,并比较其间是否存在差异.结果 HSP10在大肠腺瘤、腺癌中的阳性表达程度高于正常大肠粘膜(P<0.001);HSP10在不同程度不典型增生的大肠腺瘤、不同分化程度与淋巴结转移状态大肠腺癌中呈阳性至强阳性表达,统计学分析结果表明差异无显著性意义(P>0.05).结论提示HSP10与大肠癌的发生发展有关,有可能成为检测大肠癌的早期诊断标志物;HSP10的表达与大肠腺瘤的不典型增生程度和大肠癌的分化程度、淋巴结转移状态无关.
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热休克蛋白10、27和47在多囊卵巢综合征患者卵巢中的表达
目的:探索热休克蛋白(heat shock protein,HSP)10、27和47在多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢组织中的表达及其意义.方法:采用荧光实时定量PCR(SYBR GREEN I assay)、Western blot和免疫组织化学技术分别对3例正常妇女(对照组)、3例无排卵PCOS患者(PCOS组)卵巢组织的HSP10、HSP27和HSP47的mRNA及蛋白进行测定.结果:①HSP10 mRNA在PCOS患者卵巢组织的表达与对照组相比,差异无显著性(P＞0.05);HSP10蛋白在PCOS患者卵巢组织的表达与对照组相比,表达降低,差异有显著性(P＜0.05);免疫组化结果显示HSP10表达于对照组卵巢的所有细胞,而在PCOS组仅在卵泡膜细胞表达水平较高.②HSP27mRNA和蛋白在PCOS患者卵巢组织的表达降低与对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);免疫组化结果显示HSP27高表达于对照组卵巢原始卵泡的卵母细胞.③HSP47 mRNA和蛋白在PCOS患者卵巢组织的表达高于对照组,PCOS组卵巢,差异有显著性(P＜0.05);免疫组化结果显示HSP47高表达于PCOS组卵巢的卵母细胞、颗粒细胞和间质细胞.结论:HSP10、HSP27和HSP47在PCOS患者卵巢和正常人卵巢中存在差异表达.
关键词： 多囊卵巢综合征(PCOS) 卵巢 热休克蛋白10 热休克蛋白27 热休克蛋白47
