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重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响
目的 构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响.方法 设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ.腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1 μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态.结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致.腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%.其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P<0.05).ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P<0.05).结论 成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化.
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提高干细胞存活率治疗肝硬化
晚期肝硬化尤其是伴肝功能衰竭时,往往出现肝脏微环境的严重破坏,此时使用干细胞移植通常效果欠佳.王帅等[1-2]在观察骨髓单个核细胞移植对不同Child-Pugh分级肝硬化的生化指标的影响时发现:移植组中,Child-Pugh A级及B级患者血清胆碱酯酶(CHE)、白蛋白(ALB)提高程度较C级显著,其中Child-Pugh A级及B级患者血清CHE、ALB在移植后各时间点与移植前比较均明显升高,而C级患者血清CHE仅在移植后第8周时与移植前有统计学差异;C级患者血清ALB移植后各时间点与移植前相比均无统计学差异,对于产生以上现象的原因,认为前者肝内微环境有利于移植细胞的分化增殖,而后者肝功能损害严重、微环境恶劣不利于干细胞存活.何金秋等[3]也发现使用自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗终末期肝病时,对于Child-Turcotte-Pugh C级和(或)终末期肝病模型(MELD)>35分以上的患者,治疗效果较差.基础实验方面,骆莉莉等[4]分别用含5%、10%、15%肝损伤血清对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)进行诱导,发现5%肝损伤血清诱导hMSCs向肝细胞分化的作用不明显;10%肝损伤血清作用hMSCs后,部分细胞出现凋亡现象,随着换液次数增加,凋亡细胞也逐渐增加;15%肝损伤血清作用hMSCs后多经过2次换液,细胞就会完全丢失.
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HGF和FGF4体外诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞分化的研究
目的:探讨在HGF、FGF4诱导下人骨髓CD45-CD117-细胞能否向肝细胞分化,并探讨两种生长因子在诱导分化中可能的作用机制.方法:骨髓来自4名4-40岁健康志愿者的胸骨或髂骨.用两步磁式分离法分离出CD45-CD 117-细胞,分别用含有FGF4,HGF,HGF+FGF4或不加生长因子的DMEM培养基进行培养,相应地分为A,B,C,D四组.分别于新分离时和培养7 d,14 d,21 d,28 d时留细胞.备作免疫细胞化学检测AFP,CK18,白蛋白,PAS染色检测糖原等肝系细胞的特征型标志,RT-PCR检测C、D组细胞c-met(HGF受体)和FGFR2(FGF4R)mRNA表达情况.结果:A,B,C三组加生长因子诱导培养后的细胞均可检测到肝系细胞的标志,D组细胞不加生长因子培养后没有检测到肝系细胞的标志.c-met和FGFR2mRNA在新分离的和D组培养7 d,14 d时的细胞均有较弱的表达,而在C组细胞诱导培养7 d,14 d时表达升高.结论:HGF和FGF4可诱导人骨髓CD45-CD117-细胞向肝细胞样细胞分化.生长因子诱导分化的作用可能通过与其受体之间的正反馈调节.
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卵圆细胞及其与原发性肝癌关系的研究进展
尽年来,有关干细胞的研究已经得到广泛的注意,肝卵圆细胞(HOC)被认为是肝脏干细胞的子代,是肝脏干细胞到成熟肝细胞的中间体,他既可以向胆管细胞分化,又可向肝细胞分化.目前认为肝卵圆细胞分为三型,Ⅰ型细胞体积较小,核大,胞质少,此为原始的卵圆细胞.Ⅱ型细胞体积稍大,胞质稍多,此为向胆管上皮分化的胆管样卵圆细胞.Ⅲ型细胞体积稍大,内含稍多粗面内质网,此为向肝细胞分化的肝细胞样卵圆细胞.肝卵圆细胞定位于赫氏小管区(Hering管)和胆管树终末处,与骨髓干细胞有大量共同的表面标志,受多种细胞因子的调控,已经在体外分离培养成功,并发现存在于肝癌组织中.肝卵圆细胞"成熟受阻"可能是导致原发性肝癌的原因之一,其向原发性肝癌转化的机制仍不清楚,可能是多个癌基因和/或抑癌基因共同调控的结果.本文就此研究进展作一综述.
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肝细胞癌中金属硫蛋白表达下调及其临床病理学意义
目的:研究MT在肝细胞癌(HCC)中的表达和定位及其与临床病理特征.方法:对400例外科切除的HCC及相应非癌肝组织标本构建组织芯片,用EnVision Plus法进行MT,P53和Ki-67免疫组织化学染色.结果:与相应的非癌肝组织相比,HCC组织MT的表达显著下调,HBsAg阳性患者MT阳性率显著低于阴性者(P=0.042),肿瘤直径≤2 cm的MT阳性率显著高于肿瘤直径>2 cm者(P=0.007).随着组织学分级进程,MT表达呈降低趋势(P=0.004),MT核内表达与低分化HCC密切相关.MT与P53及Ki-67的表达无统计学相关性.结论:HCC中MT表达下调在肝癌的发生过程中有一定作用,可能是肝细胞分化的一个标志物,HBsAg与MT表达下调有关,以核染色为主的MT表达可能反映了低分化HCC的一种侵袭性行为.
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骨髓干细胞与肝细胞移植
肝细胞移植为治疗各种肝病提供了一种新的途径,其目的是通过移植细胞的增殖逐步替代或重建受损的肝组织结构.细胞来源是当前阻碍肝细胞移植发展的主要问题.骨髓干细胞可以分化为与其组织发育或再生来源不同的细胞类型,可望成为肝细胞移植的重要细胞来源问题.本文就近年来相关研究进行综述.
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可向肝细胞分化的成体干细胞研究进展
目前,常位肝移植是肝功能衰竭及先天性肝代谢疾病惟一成熟的治疗方法,但因具有操作复杂、花费昂贵、供体缺乏及病人常需终生免疫抑制等缺点,其临床应用受到极大的限制[1,2].近来,肝组织工程成为终末期肝病治疗的研究热点,并取得了显著进展.
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人源性细胞大鼠体内移植的实验研究
骨髓内存在能够向肝细胞分化的干细胞的事实已被广泛接受.然而,骨髓源性肝干细胞还不能作为生物人工肝以及肝细胞移植的细胞来源进行临床应用.主要的原因是难以通过骨髓源性干细胞获取足够数量的肝细胞.本实验通过建立肝损伤的大鼠体内微环境,将人骨髓干细胞和人肝细胞系CL-1细胞移植到大鼠肝脏内,试图实现动物肝脏人肝细胞化,获取足够的人源化肝细胞,为临床肝脏移植和生物人工肝治疗提供新的思路.
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成人肝脏干细胞研究现状及展望
Malcolm等[1]认为所谓干细胞(stem cell)为不分化而长期生存,且保持多种分化潜能的一种细胞群,而祖细胞(progenitor cell)则为一类具有分化能力、自我更新、自我维持能力受限制,仅有单向或双向分化潜能且生存时间相对较短的细胞群.近年来,成人肝脏干细胞(hepatic stem cell, HSC)的研究成了国内外研究的热点.胚胎4~6个月时,肝脏是造血的主要场所,即是红细胞、骨髓细胞、B细胞、T细胞和巨核细胞生成的场所.出生后不久,这些造血功能就停止.近年来,许多学者发现当肝组织受到严重破坏时,肝组织内幼稚细胞有分化的证据,如肝组织内一种卵圆细胞(oval cell )可分化为肝细胞、胆管上皮细胞[2,3].这种卵圆细胞被认为来自赫氏小管区(the canal of hering)和胆管树终末处[4].同时也发现了这种幼稚细胞表达大量干细胞表面的标志物,如CD34、CD45、CD38、CD69、C-kit等抗原[5-12].有学者成功分离和提纯C-kit阳性细胞,并进行了体外培养[7].于是许多学者确信成人肝组织内所存在的这种幼稚细胞来自于肝脏干细胞[5-7].但也有许多学者研究了骨髓干细胞在肝细胞再生中的作用,发现成人肝组织内的幼稚细胞直接来源于骨髓干细胞[1,8、13-15].也有学者推测这种幼稚细胞可能一部分来自于骨髓干细胞,一部分来自于肝脏自身干细胞[13].不管成人肝组织内是否真正存在自身干细胞,但祖细胞肯定存在.现已证实成人肝组织内确实存在着一种能使干细胞向淋巴细胞和肝细胞分化的微环境,且干细胞在肝损伤修复、免疫排斥和肿瘤免疫反应中发挥一定作用.我们就这些问题作一综述.
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体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝细胞横向分化
近期研究证明,某些骨髓干细胞可以分化成为肝细胞或胆管细胞[1,2],这些发现具有重要的临床应用价值,如用其来作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞,以解决供体缺乏,同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多不便.为此,作者通过肝细胞生长因子(HGF)、上皮细胞生长因子(EGF)体外诱导骨髓干细胞向肝细胞分化的研究,探索骨髓干细胞横向分化为肝细胞的作用机制.
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肝衰竭患者血浆置换前后血清诱导脐带间充质干细胞向肝细胞的分化
背景:脐带间充质干细胞治疗肝衰竭已经取得了一定的疗效,但是肝衰竭患者的血清微环境对脐带间充质干细胞分化的影响尚未见报道.目的:探讨慢加急性肝衰竭患者血浆置换前、后血清对脐带间充质干细胞向功能肝细胞分化的影响.方法:采用组织块贴壁培养法获得脐带间充质干细胞并进行细胞形态及表型鉴定;取第3代脐带间充质干细胞,用含有肝衰竭患者血浆置换前、后血清的 α-MEM培养基诱导培养,常规胎牛血清培养基为对照组,显微镜下观察各组细胞的形态,免疫组化检测细胞甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18的表达水平.结果与结论:①组织块贴壁培养法能够获得大量高纯度的脐带间充质干细胞,细胞高表达CD44,CD73,CD90,CD105,不表达CD45,符合间充质干细胞的表型特征;②慢加急性肝衰竭患者血清可改变脐带间充质干细胞的形态,并诱导脐带间充质干细胞表达甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18.血浆置换后血清组3种蛋白阳性率高于血浆置换前血清组,差异有显著性意义(P<0.05);③结果表明,肝衰竭患者血浆置换后血清更加有利于脐带间充质干细胞生长及向肝细胞分化.
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肝脏再生过程中干细胞分化调控机制的研究进展
肝干细胞属于专能干细胞,为肝内胆管系统源性具有多分化潜的细胞群.肝干细胞既可以向肝细胞分化,又可以向胆管细胞分化,是肝脏组织再生的"种子细胞".自体肝干细胞移植不会发生免疫排斥,故肝脏干细胞移植理论上可以成为终末期肝病细胞治疗的理想来源,有效解决肝脏供体严重缺乏的临床现状.本文就肝于细胞的生物学特性及其在肝脏损伤再生中的作用及调控机制综述如下.
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HNF4α与肝细胞分化调节
肝脏基因表达受肝富集转录因子(LETFs)的调控,这类肝脏内优势表达的转录因子在调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能发挥重要作用[1].肝细胞核因子(HNF)是LETFS的重要组成,HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)、D结合蛋白(DBP),对肝脏基因特异性表达起着关键的调控作用.HNF4是一种细胞核激素受体超家族的转录因子[2],包括3个亚型:HNF4α,-4β,-4γ,其组织表达谱差异较大.HNF4α和HNF4γ具有70%同源性,DNA结合区的氨基酸序列非常类似.
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肝细胞核因子4在肝细胞分化和肝细胞癌中的作用
肝细胞核因子(HNFs)是肝脏优势表达的转录因子.HNFs家族不同成员之间互相网络调控,在转录水平调控肝脏重要功能基因表达,对肝脏发育,肝脏结构和功能维持起核心作用.其中肝细胞核因子4a(HNF4a)是细胞核激素受体家族的转录因子,处于转录因子"网络调控"上游,是肝细胞分化和功能维持为关键的转录因子[1].
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肝细胞核因子与肝细胞分化基因调控
肝细胞核因子(hepatocyte nuclearfactor,HNF)家族对肝细胞分化调控起关键作用,研究发现HNF家族在肝脏内高表达并调节肝细胞众多功能基因特异性表达.HNF家族主要包括HNF1、3、4、6,CCAAT/增强子结合蛋白和D-结合蛋白,本文对HNF结构特点、生物学功能及在肝细胞分化基因调控中的作用作一综述.
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HNF4α真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达
目的:构建pcDNA3.1/HNF4α重组质粒,转染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs),并检测其在HUMSCs中的表达.方法:采用基因重组技术构建载体pcDNA3.1/HNF4α,经酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HUMSCs后,进行RT-PCR和Western blot分析,免疫荧光检测转染后1周肝特异性生化指标.结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/HNF4α,转染人脐带间充质干细胞后,RT-PCR示转染后HNF4α mRNA表达,Western blot分析见HNF4cα蛋白表达,免疫荧光示转染1周后HNF4α促进了HUMSCs向肝细胞方向分化.结论:成功构建真核表达载体,并在HUMSCs中正确表达,为进一步研究HNF4α在干细胞向肝细胞分化中作用提供了实验基础.
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肝细胞核因子4在肝细胞分化和成熟中的作用
肝细胞核因子4在肝脏发育及肝细胞的分化、成熟过程中有着重要的调控作用,通过与肝特异基因启动子结合而影响肝特异基因的表达,促进肝细胞极化结构的形成,调节肝细胞的物质代谢和生物转化,并且能够抑制肝脏肿瘤的发生.
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体外肝细胞三维培养的研究进展
肝细胞体外培养如何能长时间维持肝细胞分化表型及功能活力,是目前生物人工肝研究关键问题之一。体外培养细胞功能改善的一个重要原则就是模拟体内细胞环境,由此,众多研究学者提出体外肝细胞三维培养是解决上述问题的有效途径。近年来,国内外在该领域取得了较大的进展,使体外肝细胞培养功能活力、细胞分化表型维持时间都大大延长。本文就近年来体外肝细胞三维培养的研究进展、存在问题及展望做一简要综述。
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经不同方式移植骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的疗效
目的:探索经不同方式移植骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)治疗肝纤维化的疗效.方法:P4代骨髓间充质干细胞经培养并诱使其向肝细胞样细胞分化;通过CCL4制作大鼠肝纤维化模型.骨髓间充质干细胞通过静脉内、肝内、及腹腔注射等移植方式.通过组织学染色,免疫组织化学和生化分析比较不同移植方式对肝脏形态及功能的影响.结果:MSCs经诱导后不表达肝细胞标记物,而表达α-胎蛋白(AFP),白蛋白(ALB);组织学染色,免疫组化,及生化分析表明经静脉途径比其他途径更有利于挽救肝衰竭.结论:MSCs移植能抵抗肝脏纤维化,静脉移植方式是有效的治疗途径.
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骨髓间充质干细胞与乙肝病毒的相互作用
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)作为一种易分离、纯化、体外扩增、多能分化的干细胞,在细胞因子的帮助下可以增殖、迁移,分化成肝细胞并具有其功能,同时拥有弱的免疫原性。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)可以感染BM MSCs并在其内表达,导致其增殖匮乏,但不会影响它的免疫表型、向肝细胞分化并具有肝细胞样作用的能力。同时BM MSCs可以通过消除在其细胞内的HBV而抵制其长期感染机体。所以研究者们考虑使用BM MSCs移植疗法来治疗乙型肝炎晚期肝硬化、肝癌的患者,有效减轻排斥反应,为今后的临床应用提供更合适的方法。