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肝细胞向胆管上皮细胞转分化在继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维化形成中的作用及黄芪汤组分的干预效应
目的 探讨肝细胞向胆管上皮细胞转分化在继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维化形成中的作用及黄芪汤组分抑制肝纤维化的效应机制.方法 75只SD雄性大鼠,采用胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)制备继发性胆汁淤积性肝纤维化模型,假手术组(Sham)仅作胆总管分离,不作胆总管结扎.大鼠BDL术后1周随机分为对照组(M)与干预组(Y组,经灌胃给予黄芪汤组分4周),Sham组于术后1周末随机抽取5只大鼠处死取材,M组分别于术后1、2、3、4周末随机抽取5只大鼠做动态观察,余下各组大鼠均于术后第5周末处死取材.观测肝脏组织学及羟脯氨酸(Hyp)含量;激光共聚焦显微镜观察肝组织胆管上皮细胞标志物角蛋白-7(cK7)与肝细胞特异性抗原(Hep Par)共定位,Western blot检测CK7、Hep Par的蛋白表达,IPP软件分析肝组织天狼猩红胶原染色.结果 随着造模时间推移,M组大鼠肝组织肝细胞Hep Par阳性细胞逐渐减少(Sham>M1周>M2周>M3周>M4周>M5周),胆管上皮细胞(CK7阳性细胞)及纤维化程度、Hyp含量、CK7蛋白表达均逐渐增加(Sham
关键词： 继发性胆汁淤积性肝纤维化 肝细胞 胆管上皮细胞 转分化 黄芪汤 -
5-氟尿嘧啶抑制TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化
目的 探讨5-氟尿嘧啶对TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化的抑制作用,并探讨其作用机制.方法 原代培养人肝内胆管上皮细胞,角蛋白19荧光染色鉴定;细胞分为:对照(normal)组,TGF-β1(TGF-β1)组,5-氟尿嘧啶(TGF-β1+5-FU)组;免疫荧光染色观察CK-19、E-cadherin、vimentin和α-SMA标记蛋白;Western blot检测细胞标记蛋白及TGF-β1表达量;Real-time PCR检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量.结果 原代培养的人肝内胆管上皮细胞呈多边形或者锥形,CK-19荧光染色为胞质着色;TGF-β1诱导72 h后,胆管上皮出现间质化表现,与正常组比较,vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显增强(P<0.05),CK-19和E-cadherin表达显著减弱(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ 型胶原及TGF-β1 mRNA含量显著升高(P<0.05);5-FU抑制胆管上皮间质化,与TGF-β1组比较,CK-19和E-cadherin表达增强(P<0.05),vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显减弱(P<0.05),TGF-β1 mRNA和Ⅲ 型胶原mRNA含量明显降低(P<0.05).结论 5-FU通过下调TGF-β1的表达抑制胆管上皮细胞间质化.
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β-catenin在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化过程中的定位、表达及意义
目的 探讨肝纤维化发生过程中β-连环蛋白(β-catenin)定位、表达及意义.方法 健康雄性昆明小鼠(n=45)随机分为对照组(n=15)与实验组(n=30).实验组小鼠皮下注射50% 四氯化碳(CCl4)-粟米油混合液(6ml/kg),2次∕周,对照组皮下注射同等剂量的粟米油.各组分别于造模1周、4周和8周后取小鼠肝脏,常规制作石蜡切片,Masson染色及Desmin免疫组织化学法观察比较不同组别小鼠肝纤维化病理变化,RT-PCR及免疫组织化学方法检测不同时间点各组小鼠肝组织内β-catenin的表达及定位.结果 Masson染色结果显示,对照组肝汇管区结缔组织内及血管壁有少量细小纤维,实验组小鼠肝脏汇管区和中央静脉及其周围胶原纤维增多;随损伤时间延长纤维增生愈加明显.Desmin免疫组织化学结果显示,各组别均有阳性表达,但损伤组各时间点desmin阳性表达细胞数明显高于对照组(P<0.05 或P<0.001).RT-PCR结果显示,CCl4损伤1周后肝内β-catenin mRNA水平与对照组相比无明显差别(P＞0.05),损伤4周及8周β-catenin mRNA水平则明显下降,与对照组相比差异均有显著性(P<0.01).免疫组织化学结果显示,对照组β-catenin弱表达于肝细胞膜及胆管上皮细胞膜和胞质,而损伤组β-catenin阳性反应主要定位于肝内增生的细胞团及新生胆管上皮细胞质,各组间积分吸光度值差别有显著性(P<0.01).结论 CCl4诱导的肝纤维化过程中β-catenin mRNA表达与蛋白表达不同步,阳性表达细胞主要为新生的细胞团及胆管上皮细胞.
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共刺激分子在原发性胆汁淤积性肝硬化中的研究进展
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种慢性渐进性自身免疫性肝病，特征是汇管区淋巴细胞浸润和胆管上皮细胞的选择性破坏[1-3]。90%~95% PBC患者血清中都会出现高低度抗线粒体抗体（anti-mitochondrial antibody，AMA）阳性。PBC病因不明，可能是环境、免疫紊乱、遗传变异等多种因素共同作用的结果。研究表明 PBC的发生与 T细胞的异常活化有关。原始 T细胞的活化不仅需要 TCR/CD3复合物与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）I、II类分子的相互作用和识别，还需要共刺激分子的共同参与。共刺激分子是指参与免疫反应的辅助分子，存在于 T、B淋巴细胞、抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面。共刺激信号在免疫应答中起着极其重要的作用，是决定受到抗原刺激的 T细胞有效激发、适度效应和适时终止的关键因素。PBC的发病机制主要是自身反应性 T细胞的过度免疫反应。因此，控制自身反应性 T细胞的活化和效应功能成为 PBC重要的潜在治疗靶点。现就共刺激分子 CD28/B7、CTLA-4/B7、PD-1/PD-L1、PD-L2在 PBC的免疫发病机制和相关治疗综述如下。
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运用荧光原位杂交技术辅助诊断胆管癌方法初探
胆管癌是指发生于胆道树各部位胆管上皮细胞恶性肿瘤，按照部位一般分为肝内胆管癌（ ICC ）、肝门部胆管癌（PHCC）和远端胆管癌（DBDC），分别占10％、50％和40％。依靠影像学判断良、恶性胆管狭窄较为困难，胆管癌确诊时往往已是晚期，患者生存期约有6～12个月。早期进行外科手术仍是胆管癌唯一的治愈手段，早期诊断非常重要。超声和肿瘤标志物糖类抗原19-9（ CA19-9）的联合检查对于发现早期胆管癌很有帮助。如果这2项检查有可疑的发现，患者一般会被建议再行磁共振胰胆管造影（ MRCP ）检查和内镜逆行胰胆管造影（ ERCP）。在ERCP的结果中获得狭窄处的胆管刷检和活检标本，可进行细胞学和病理检查来诊断胆管癌［1］。由于胆管癌一般是沿着胆管纵向生长而不是显著放射性生长［2］，影像学横断面成像并不一定能检测到胆管癌的发生，而且刷检细胞学检查的阳性率仍很低［3］。目前仍缺乏特异、敏感的诊断标志物，因此用更加敏感可行的方法来辅助诊断胆管癌就显得更加重要。
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射频消融治疗肝内胆管细胞癌的应用现状
肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)为来源于胆管二级分支以下的肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤.ICC占肝脏原发恶性肿瘤的5%-10%[1-2],占所有胆管细胞癌的10%,近年来发病率在全世界范围内呈持续上升趋势[3-4].据WHO统计,2002年全球ICC 62.6万例,80%来自发展中国家,中国占55%.
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肝脏干细胞研究进展
干细胞是不分化而长期生存,具有自我更新能力且保持多种分化潜能的一种细胞群.从功能上定义,肝脏干细胞(hepatic stem cell,HSC)是指在特定的条件下能增殖分化为有功能的肝脏组织的细胞.根据肝脏干细胞的存在位置,分为内源性肝脏干细胞和外源性肝脏干细胞2种.内源性肝脏干细胞存在于肝脏组织本身,是未分化的、多潜能的、具有干细胞以及肝细胞或胆管细胞标记的、非肝实质细胞的上皮细胞前体细胞,目前认为卵圆细胞和小肝细胞属于这一类.外源性肝脏干细胞,本身不存在于肝脏内,包括:骨髓细胞、胰腺细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞等,但在特定的微环境中可以分化为肝细胞和(或)胆管上皮细胞.
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轮状病毒全身感染对肝胆胰的影响
目的:进一步了解轮状病毒(RV)全身扩散后对肝、胆、胰的影响,为指导临床的早期诊断与治疗提供有价值参考.方法:观察RV胃肠炎患儿肝、胆、胰损伤的临床表现和化验变化;采用光镜、电镜观察RV胃肠炎死亡患儿,人类RV感染小鼠模型的组织病理变化,采用原位PCR技术获取肝、胆、胰组织RV感染的直接证据.结果:RV胃肠炎患儿肝酶ALT、AST分别升高者占36.59%和78.05%,2项均显著升高者占7.32%;胰淀粉酶显著增高1例,胆指标均在正常范围内.光镜下RV胃肠炎死亡患儿肝细胞浊肿,明显脂肪变性,RV感染小鼠肝窦血管扩张充血、灶性坏死,汇管区和小叶内淋巴细胞、浆细胞浸润,胆道充血,胰腺无明显异常.电镜下RV感染小鼠肝细胞中存在大量脂滴和空泡,肝脏线粒体凝集病变明显,毛细胆管明显扩张,微绒毛脱落.原位PCR结果:RV胃肠炎死亡患儿肠、肝呈阳性,RV感染小鼠胆管上皮细胞和腺体,肝细胞膜、胞质以及枯否细胞胞质,胰腺细胞呈阳性显色.结论:人类RV一旦扩散至全身后,对肝、胆、胰可造成不同程度的损伤.
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TNF-α激活大鼠胆管上皮细胞Jagged-1的表达并诱导其上皮-间质转化
目的:检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)对体外培养的原代大鼠肝内胆管上皮细胞Jagged-1表达的影响以及诱导其间质-上皮转化的作用.方法:原代胆管上皮细胞分为对照组,TNF-α处理组(10 ng/mL),TNF-α加核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制剂PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate)(50μmol/L)处理组及PDTC单独处理组,72 h后Western blot法检测各组细胞Jagged-1蛋白、间质细胞标记成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein 1,FSP-1)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)和胆管细胞特异性标记角蛋白19片段(cytokeratin 19,CK19)的蛋白的表达,凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-κB蛋白结合活性.倒置显微镜观察各组胆管细胞的形态变化,Transwell小室法检测细胞的迁移能力.结果:TNF-α处理组胆管上皮细胞NF-κB的活性增强,Jagged-1、FSP-1、Vimentin和α-SMA蛋白的表达水平上调,CK19的表达下调,细胞迁移能力增强,细胞形态由鹅卵石样向梭形样转化.TNF-α+PDTC与TNF-α组相比其NF-κB活性明显减弱,Jagged-1,FSP-1,Vimentin和α-SMA蛋白水平降低,CK19表达升高,细胞迁移能力减弱,细胞形态向鹅卵石样转化.结论:TNF-α可通过激活NF-κB信号上调Jagged-1蛋白表达的同时诱导大鼠胆管上皮细胞向间质细胞转化.
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原发性胆汁性肝硬化发病机制的研究进展
原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性进行性胆汁淤积性自身免疫性肝病,以肝内小胆管破坏及血清高特异性抗线粒体抗体(antimitochondrial antibodies,AMAs)增加为特征.人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)与PBC的易感性显著相关,非HLA基因,包括IL12A、IL12RB2、STAT4、IRF5-TNPO3、ORMDL3/IKZF3、MMEL1、SPIB、CTLA-4、FCRL3和A2BP1等也与PBC的易感性密切相关.4个AMAs(抗-M2、抗-M4、抗-M8、抗-M9)、抗核抗体(ANAs),包括抗多核点抗体(SP100、PML、NDP52和SP140)、抗核孔抗体(gp210和p62)、抗核膜抗体(核板层蛋白、核板层蛋白B受体)及抗着丝粒抗体可能也涉及PBC的发病机制.Th17细胞/调节性T细胞(Treg)的免疫失衡在PBC的发病机制中可能起重要作用,此外,胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)的衰老、自噬、凋亡以及环境因素,如EB病毒-(EBV)感染、吸烟等可能也参与PBC的发病.这些新研究进展为PBC的治疗提供了新的思路.
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诱导多能干细胞-iPSCs在胆管病研究中的应用
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是在形态、基因表达、细胞自我更新、以及分化潜能等方面与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)相似的一类细胞,但却避免了ESCs应用中的免疫排斥和伦理道德等问题.iPSCs在多种疾病研究上取得的成就为肝脏疾病提供了良好的借鉴.以原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等为代表的一组胆管病虽非常见疾病,但发病机制不清、有效治疗手段匮乏、预后差.因此发展胆管病患者源性的、个体化的iPSCs及其诱导分化的功能细胞可在体外模拟疾病的表型及病理过程,应用此细胞模型对研究发病机制、药物筛选和疗效评估等具有重要意义.
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胆管癌的病因及诊断分析
胆管癌起源于胆管上皮细胞、卵圆细胞或介于两者之间的非上皮性母细胞样细胞,占肝胆系统恶性肿瘤的10%～15%.近年文献显示,其发病率和病死率有逐年升高的趋势.究其原因,与目前缺乏早期诊断胆管癌的手段和对胆管癌发病机制无深入了解有关.为寻求胆管癌发生的高危因素及其诊断,回顾性总结及分析了同济大学附属第十人民医院1983年1月至2004年3月间经病理证实的66例胆管癌临床资料.
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慢性梗阻性黄疸对胆管癌神经浸润的影响
一、胆管癌神经浸润机制的研究胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤.具有恶性程度高,预后恶劣的特点,目前在全世界范围的发病率都逐年增加[1],其具有神经浸润的特点使得在治疗上更为棘手.由于神经浸润与否与术后复发率及预后密切相关,故越来越受到人们的重视.然而目前对于胆管癌神经浸润机制的研究相对较少,且多集中在国内.
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上皮-间质转化相关标志蛋白在胆管癌中的表达及其临床预后评估意义
胆管癌是一种恶性程度极高的肿瘤.它起源于胆管上皮细胞,是仅次于肝癌的第二位肝胆恶性肿瘤[1,2].由于大多数胆管癌患者在得到确诊时已是疾病的晚期,故总体预后差.只有行根治性切除才能使患者获得佳疗效,但术后肿瘤的复发率仍然非常高[3,4],这往往与患者早期即发生肿瘤浸润转移有关.上皮细胞来源肿瘤在发生局部浸润和远处转移的过程中会涉及到多个机制的激活.越来越多的研究证实上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤侵袭和转移的早期事件,也是肿瘤细胞具有迁移性和侵袭性的一个主要原因[5].本研究应用免疫组化法检测了EMT相关标志物在胆管癌组织中的表达,旨在探讨胆管癌发生发展过程中是否发生了EMT现象,并分析其与临床病理因素及临床预后的关系,以期为胆管癌的预后评估提供有参考价值的分子生物学指标.
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肝细胞肝癌微创综合治疗的现状与展望
原发性肝癌指发生于肝细胞与肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤,是人类常见的恶性肿瘤之一.在我国的原发性肝癌患者中,肝细胞肝癌(肝癌)占80%～90%,其次为胆管细胞型肝癌和肝细胞胆管细胞混合型肝癌.肝癌一般在肝炎、肝硬化基础上发生的.传统的观点认为,肝癌发病隐匿,自然病程24个月,前18 个月多无症状,一旦出现症状,往往病灶已较大,失去外科手术切除的机会,多于确诊后3～6 个月后死亡.
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成人肝脏干细胞研究现状及展望
Malcolm等[1]认为所谓干细胞(stem cell)为不分化而长期生存,且保持多种分化潜能的一种细胞群,而祖细胞(progenitor cell)则为一类具有分化能力、自我更新、自我维持能力受限制,仅有单向或双向分化潜能且生存时间相对较短的细胞群.近年来,成人肝脏干细胞(hepatic stem cell, HSC)的研究成了国内外研究的热点.胚胎4～6个月时,肝脏是造血的主要场所,即是红细胞、骨髓细胞、B细胞、T细胞和巨核细胞生成的场所.出生后不久,这些造血功能就停止.近年来,许多学者发现当肝组织受到严重破坏时,肝组织内幼稚细胞有分化的证据,如肝组织内一种卵圆细胞(oval cell )可分化为肝细胞、胆管上皮细胞[2,3].这种卵圆细胞被认为来自赫氏小管区(the canal of hering)和胆管树终末处[4].同时也发现了这种幼稚细胞表达大量干细胞表面的标志物,如CD34、CD45、CD38、CD69、C-kit等抗原[5-12].有学者成功分离和提纯C-kit阳性细胞,并进行了体外培养[7].于是许多学者确信成人肝组织内所存在的这种幼稚细胞来自于肝脏干细胞[5-7].但也有许多学者研究了骨髓干细胞在肝细胞再生中的作用,发现成人肝组织内的幼稚细胞直接来源于骨髓干细胞[1,8、13-15].也有学者推测这种幼稚细胞可能一部分来自于骨髓干细胞,一部分来自于肝脏自身干细胞[13].不管成人肝组织内是否真正存在自身干细胞,但祖细胞肯定存在.现已证实成人肝组织内确实存在着一种能使干细胞向淋巴细胞和肝细胞分化的微环境,且干细胞在肝损伤修复、免疫排斥和肿瘤免疫反应中发挥一定作用.我们就这些问题作一综述.
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肝内胆管细胞癌研究进展
胆管细胞癌根据解剖位置分为肝内、肝门部和远端肝外胆管细胞癌.肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)发生于二级胆管以上的末梢侧肝内小胆管,起自肝内胆管上皮细胞,占胆管细胞癌的5%～10%~[1].
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胆管上皮细胞与缺血再灌注损伤的研究进展
随着肝移植术后胆道并发症研究的进展，缺血再灌注损伤越来越受到关注。然而，关于胆管上皮细胞与缺血再灌注损伤的相关研究尚少。目前，缺血再灌注损伤引起的胆道病变临床诊治相当棘手，其发病机制是多方面的，主要包括能量代谢紊乱、器官缺血产生的微血管功能障碍以及再灌注损伤引起的炎症免疫反应。本文对肝移植后胆管缺血再灌注损伤的病理生理学机制、影像学诊断及药理学防治的研究状况作一系统分析，以揭示缺血再灌注损伤与胆管疾病之间的关系，为肝移植术后胆道并发症的临床诊治提供有价值的信息。
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5-羟色胺在胆管上皮细胞与门管成纤维细胞自分泌/旁分泌中的作用
目的 探讨5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)在胆管上皮细胞(biliary epithelia cells,BECs)与门管区成纤维细胞(portal fibroblasts,PFs)之间自分泌/旁分泌效应中的意义,阐述两种细胞之间的相互作用.方法 体外细胞培养分为6组:1)BECs组单独培养;2)BECs+ TGF-β1组,BECs单独培养,用2 ng/ml重组TGF-β1干预24 h后更换培养液;3)BECs+5-HT组,BECs单独培养,以60 ng/ml的5-HT干预48 h后更换培养液;4)PFs组单独培养;5)PFs+ 5-HT组,PFs单独培养,以60 ng/ml的5-HT干预48 h后更换培养液;6)BECs+ PFs,共同培养.各组均在培养72 h后,以酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测培养介质内5-HT、TGF-β1含量;实时荧光定量多聚酶链反应(QRT-PCR)检测BECs内色氨酸羟化酶(TPH1、TPH2)和5-HT受体1A、1B表达;以BrdU、α-SMA分别作为BECs增殖及PFs转化为肌纤维母细胞(myofibroblasts,MFs)的标志,免疫细胞化学检测.结果 单独培养的BECs表达5-HT合成限速酶TPH1、TPH2及5-HTR1A、5-HTR 1B,5-HT分泌较高而BECs增殖不明显;经TGF-β1处理或与PFs共培养后,TPH1、TPH2表达各减少80％和87％,5-HTR1A、5-HTR1B表达分别减少75％和85％,BECs增殖明显.单独培养的PFs分泌TGF-β1,部分呈α-SMA阳性的MFs;经5-HT处理或与BECs共培养后,TGF-β1表达及MFs显著增加.结论 BECs来源的5-HT以及PFs来源的TGF-β1介导BECs与PFs之间的自分泌与旁分泌效应,维持BECs增殖和PFs向MFs的转化,在胆管病发病机制中可能具有重要意义.
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肝脏干细胞的研究进展
肝脏是哺乳类动物和人类重要的消化器官,参与体内蛋白质、糖类、脂类等重要生物大分子的代谢,胚胎肝和某些病理状态下可以重新造血.很早发现各种生物、理化因素引起肝细胞损伤的同时,伴随着新生肝细胞的再生、分化和成熟,以维持肝脏功能的正常发挥.20世纪80年代以来,一些研究者发现大鼠实验性肝癌组织中存在一种卵圆细胞,以后在人肝脏中也找到这种卵圆细胞,目前认为,它是肝脏专能干细胞,在肝脏的微环境调控下,可以分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞[1,2].
