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肝干细胞的研究进展
肝干细胞的来源主要有以下几个方面:1.肝实质细胞;2.卵圆细胞;3.骨髓造血干细胞;4.胚胎肝细胞;5、肝细胞样祖细胞.本文就近几年肝干细胞的来源及其分化的相关文献作一综述.
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大鼠肝卵圆细胞增殖模型建立及其表面标记检测
本文拟建立大鼠卵圆细胞增殖模型,分离纯化卵圆细胞并对其特性进行研究.给SD大鼠喂饲2-乙酰氨基芴(2-AAF),剂量分别为5、10、15、20mg/kg,连续给药6d,第7天行三分之二肝切除术,术后继续给药1周,并于术后每隔3d取肝组织行常规组织学观察、细胞增殖试验及免疫组化染色.经免疫磁珠标记C-kit阳性细胞以纯化卵圆细胞,再经免疫细胞化学及RT-PCR对其进行鉴定.结果显示,10、15、20mg/kg三种剂量2-AAF均可成功建立卵圆细胞增殖模型,卵圆细胞增殖于第8天较明显,至第11天达高峰,第14天有所减少.卵圆细胞胞核BrdU染色阳性,卵圆细胞表达特异性抗原OV6、肝细胞标记白蛋白、胆管细胞标记CK19、甲胎蛋白以及连接蛋白43,同时还表达造血干细胞标记C-kit.实验表明,2-AAF剂量为10～20mg/kg时可获得较理想的大鼠卵圆细胞增殖模型,增生的卵圆细胞为具有双向分化潜能的肝干细胞/前体细胞.
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肝脏干细胞的研究进展
干细胞为机体进化过程中高度保守的细胞族,在机体细胞再生调控中具有特殊的作用.目前认为以肝内胆管系统源性为主的多潜能肝脏干细胞分化群,既可向胆管细胞分化,又可向肝细胞分化.近年来,在现代细胞生物学、分子生物学及分子遗传学研究推动下,有关肝脏干细胞定位、来源、发生、演变、功能及体外培养、鉴定技术等研究取得了较大进展,本文将近年来的主要进展作一综述.
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重组肝刺激因子对肝脏卵圆细胞增殖的作用
目的观察重组人肝刺激因子(hHSS)对肝脏卵圆细胞增殖的影响.方法分离大鼠肝卵圆细胞,加以培养,并进行细胞学鉴定.将重组的hHSS作用于肝脏卵圆细胞,以MTT法、流式细胞术观察其对卵圆细胞的增殖作用.结果实验分离的卵圆细胞同时表达肝细胞和胆管细胞特异性标志物.给予重组hHSS作用12～24 h后,细胞增殖速度减缓,细胞DNA合成减弱,其作用的有效浓度为240 mg/L.结论重组hHSS能抑制卵圆细胞的增殖.
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经典的Wnt信号通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖和分化中的作用
目的 探讨激活经典的Wnt信号转导通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖、分化中的作用.方法 不同浓度的重组Wnt3a纯化蛋白(20,40,80,160,200 ng/ml)在无血清培养条件下作用WB-F344细胞24 h,Brdu掺入法检测细胞增殖情况.160 ng/ml重组Wnt3a纯化蛋白在无血清条件下作用WB-F344细胞,作用24 h后通过免疫荧光观察β-catenin亚细胞定位的变化,Western-blot观察β-catenin蛋白表达的变化;半定量RT-PCR观察下游靶基因CyclinDl mRNA表达的变化.作用72 h后通过RT-PCR观察CK-19,AFP,ALB,HNF-6,HNF-4αmRNA表达的变化,Western-blot观察CK-19,AFP蛋白表达的变化.以同期未做处理的WB-F344细胞作为空白对照.结果 不同浓度的重组Wnt3a纯化蛋白作用后,处理组WB-F344细胞以剂量依赖方式增殖,Wnt3a处理组明显高于空白对照组(P<0.05),160 ng/ml作用时,增殖达到高峰.Wnt3a(160 ng/m1)作用24 h后,通过免疫荧光共聚焦观察β-catenin的亚细胞定位发现,处理组β-catenin在WB-F344主要在细胞核中表达;而未处理组主要在核周表达;Western-blot发现处理组β-catenin蛋白表达轻度增加;半定量RT-PCR发现下游靶基因CyclinDl mRNA的表达显著增加(P<0.01).72 h后,RT-PCR发现两组中均有AFP,CK-19,HNF-6,HNF4-α基因表达,而ALB在两组中均不表达;同时通过Western-blot发现AFP,CK-19蛋白在两组中均有表达.结论 激活经典的Wnt信号转导通路促进大鼠肝脏卵圆细胞系WB-F344的增殖和自我更新.
关键词： 经典的Wnt信号通路 卵圆细胞 增殖 自我更新 -
CK19及C-kit蛋白在DEN诱发大鼠肝癌过程中的表达及意义
目的：观察在大鼠诱发性肝癌中肝脏组织中细胞角质素19（CK19）及C-kit（CD117）蛋白的表达，探讨其在肝癌发生发展过程中的意义。方法利用二乙基亚硝胺（DEN）制备诱发性大鼠肝癌模型，在此模型的基础上，HE染色观察肝组织的形态学变化，免疫组织化学法检测CK19及 C-kit 蛋白的表达。结果根据肝组织形态学变化将诱癌过程分为肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期。胆管上皮、卵圆细胞、癌周组织中的细胞和少量癌细胞上均可见 CK19蛋白阳性表达；C-kit蛋白表达在卵圆细胞，并随着诱癌的进行出现向肝小叶内穿插的现象。结论 CK19及C-kit蛋白标记的卵圆细胞是大鼠DEN诱发性肝癌发生发展的启动细胞。
关键词： 肝肿瘤 原癌基因蛋白质C-kit 二乙基亚硝胺 CK19蛋白 卵圆细胞 -
肝脏干细胞研究进展
干细胞是不分化而长期生存,具有自我更新能力且保持多种分化潜能的一种细胞群.从功能上定义,肝脏干细胞(hepatic stem cell,HSC)是指在特定的条件下能增殖分化为有功能的肝脏组织的细胞.根据肝脏干细胞的存在位置,分为内源性肝脏干细胞和外源性肝脏干细胞2种.内源性肝脏干细胞存在于肝脏组织本身,是未分化的、多潜能的、具有干细胞以及肝细胞或胆管细胞标记的、非肝实质细胞的上皮细胞前体细胞,目前认为卵圆细胞和小肝细胞属于这一类.外源性肝脏干细胞,本身不存在于肝脏内,包括:骨髓细胞、胰腺细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞等,但在特定的微环境中可以分化为肝细胞和(或)胆管上皮细胞.
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胞外基质Matrilin-2在肝再生中与大鼠卵圆细胞的关系
目的:探讨肝脏胞外基质Matrilin-2在肝再生中与卵圆细胞的关系及作用.方法:采用改良的Soft-Farber建立大鼠肝脏卵圆细胞增殖模型,对照组灌喂生理盐水.分别取术后2、4、6、9、12、15 d大鼠肝组织,采用免疫组织化学以及Western blot的方法动态观察大鼠卵圆细胞增殖模型中肝脏胞外基质成分Matrilin-2的变化与卵圆细胞的关系.结果:肝脏部分切除术(partial hepatectomy,PH)后第2天,卵圆细胞开始向门静脉周围区域增殖,Matrilin-2主要出现在门静脉周围的肝窦状隙内;术后第9天,卵圆细胞进一步向肝实质内增殖,Matrilin-2表达增加;术后第12天,随着卵圆细胞分化为小肝细胞结节,大多数Matrilin-2位于结节周边,少数出现在结节内.Matrilin-2的含量自肝切除后第2天开始升高,第9天达到高峰,第12天后逐步恢复生理水平.结论:肝脏胞外基质成分Matrilin-2与卵圆细胞介导的肝脏再生存在紧密联系并发挥重要的调控作用.
关键词： 卵圆细胞 肝脏部分切除 肝再生 Matrilin-2 -
大鼠肝卵圆细胞参与肝损伤的修复过程和癌变
目的:探索卵圆细胞在参与实验性肝损伤修复过程中的作用和地位.方法:清洁型SD大鼠随机分为正常组20只和实验组40只,各组于肝癌造模后的不同时段取肝组织标本进行常规病理和C-kit,PCNA免疫组化检测.结果:正常组大鼠肝脏表面光滑,组织学形态正常,偶见C-kit和PCNA阳性细胞.实验组于肝脏染毒2wk,首先于汇管区发现卵圆细胞沿胆管上皮依次排列增生,这些卵圆细胞呈C-kit和PCNA阳性表达.随着染毒加重,大量卵圆细胞以汇管区为中心向肝小叶穿插生长,正常肝细胞逐渐固缩、消亡.肝癌形成时,癌结节内外均见有卵圆细胞聚集.结论:卵圆细胞在肝损伤修复中发挥主导作用;与肝癌的发生密切相关.
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大鼠实验性肝癌发生中卵圆细胞的变化
目的:探讨卵圆细胞在大鼠肝癌发生、发展过程中的作用.方法:60只SD大鼠随机分为对照组(n=12)和实验组(n=48).用化学致癌剂3'-甲基-4-二甲基氨偶氮苯(3'-Me-DAB)诱发大鼠肝癌,通过免疫组织化学、RT-PCR,Western blot技术对大鼠诱癌过程(4,8,12,16,20,24 wk)中肝组织内卵圆细胞及p53基因表达的变化进行动态的检测.结果:诱癌4 wk,大鼠肝门管区及坏死区内均见大量卵圆细胞,这些细胞呈OV-6染色阳性.诱癌16 wk,肝组织内可见癌结节形成,癌结节内外均可见有卵圆细胞聚集,部分增生的卵圆细胞P53阳性反应,二者的分布区域基本一致.诱癌20 wk后大鼠肝癌组织内的p53 mRNA(F=4.78,P＜0.05),P53蛋白水平均显著升高(F=2.46,P＜0.05).结论:卵圆细胞贯穿了大鼠受化学诱癌剂作用后发生肝癌的全过程,与肝癌的发生有着密切的联系;其机制可能与p53基因的突变有关.
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苦参碱诱导大鼠肝卵圆细胞株WB-F 344细胞分化中Wnt-1信号通路的作用
目的: 研究苦参碱干预体外培养的大鼠肝卵圆细胞分化中Wnt-1信号通路的作用.方法: 体外培养大鼠肝卵圆细胞,分别用不同浓度的苦参碱(0.001、0.01、0.05、0.2、0.5、1、1.5、2 g/L)处理卵圆细胞,HE染色观察细胞的形态变化,免疫细胞化学检测细胞内甲胎蛋白、白蛋白、Wnt-1信号蛋白的表达.结果: 苦参碱对肝卵圆细胞的生长有抑制作用,且苦参碱浓度越大,作用时间越长,抑制作用越明显,0.05、0.2、1 g/L的苦参碱作用72 h后,对卵圆细胞的抑制率分别为24.16%±2.03%、40.25%±3.92%和67.31%±6.04%.0.01 g/L的苦参碱即可使肝卵圆细胞的形态发生变化,细胞核变大、变圆,核浆比例减小,双核细胞增多;免疫细胞化学结果显示,0.2 g/L的苦参碱能够使肝卵圆细胞的ALB表达增高,AFP的表达降低,Wnt-1信号蛋白的表达量降低.结论: 苦参碱可以抑制Wnt信号通路的传导,使卵圆细胞向着成熟肝细胞的趋势分化.
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骨髓源性肝干细胞的研究进展
近年来干细胞研究取得了很大进展,但是人类胚胎在研究中的应用一直备受争议,因此有关成人体内某些干细胞的受重视程度日益增加.骨髓中的某些干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型.卵圆细胞是一种存在于肝脏实质的专能干细胞,研究首先发现了人及动物肝内存在骨髓来源的卵圆细胞,之后体外骨髓干细胞向肝干细胞的成功诱导,使这种现象的存在得到了进一步证实.骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现提示他可能参与了体内肝组织细胞的再生及损伤的修复与替代,并为难治性肝病的治疗提供了新的思路.但是,就目前研究状况而言,许多方面尚存在疑问,骨髓源性肝干细胞的临床应用价值如何还有待于进一步研究.
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肝干细胞的研究进展
肝干细胞的存在与否曾是一个争议性问题,目前则趋于肯定,并取得重要研究进展.肝干细胞有肝源性和非肝源性两类,前者包括胆管源性卵圆细胞和分化肝细胞,后者包括胚胎干细胞(ES细胞)、骨髓/血液干细胞及胰腺上皮细胞等.肝干细胞受多种细胞因子调节;卵圆细胞可通过流式细胞仪分离,经特殊培养液培养条件及遗传学改造等进行长期培养;肝干细胞与肝坏死后的再生及增生有关,也和肝细胞癌变有关.已在动物中成功进行了肝源性和非肝源性肝干细胞移植.肝干细胞是研究肝细胞发育、生长、增生、再生、纤维化及癌变等生理和病理生理过程中不可缺少的关键角色,并可能通过肝细胞移植、体外生物人工肝及肝导向基因治疗,在多种肝病及肝脏相关疾病中发挥重要作用.
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细胞角质素CK18和CK19在肝细胞癌组织中的表达
目的:观察和探讨细胞角质素CK18和CK19在不同肝组织中的表达及其意义.方法:采用免疫组化SP法观察正常肝组织8例.肝硬化组织27例和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织43例中CK18,CK19的表达.结果:肝CK18和CK19在肝硬化组与正常肝组织的表达率均无明显差异,但两者在肝细胞癌组与肝硬化组之间差异有显著性(65.1%vs29.6%.69.8%vs 25.9%,P＜0.01).在20/27例肝硬化组织和35/43例HCC组织中可见到CK18,CK19标记的卵圆细胞,且在两种组织中卵圆细胞的数量有显著性差异(CK18:6.57-4-1.69vs 10.70±2.31:CK19:5.37±1.17vs10.45±2.15,P＜0.01).结论:CK18和CK19参与了肝硬化到HCC的癌变过程;CK18和CK19在卵圆细胞中的强阳性表达,支持HCC的卵圆细胞起源学说.
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细胞角质素19及消减基因P02在肝细胞癌组织及卵圆细胞中的表达
目的:观察细胞角质素19(CK19)及消减基因P02在肝细胞癌,肝硬化组织及卵圆细胞中的表达情况.方法:采用免疫组化SP法观察8例正常肝组织,27例肝硬化组织和43例肝细胞癌组织中CK19的表达.采用DIG-probe synthesis kit,聚合酶链反应方法制备P02探针,通过原位杂交方法检测P02在肝细胞癌,肝硬化组织及卵圆细胞中的表达.结果:CK19在肝硬化组与正常肝组织之间表达率无明显差异,但在肝细胞癌组与肝硬化组之间差异有显著性(69.77% vs 25.93%,P＜0.01).肝硬化组织与肝细胞癌组织中CK19标记的卵圆细胞数量有显著性差异(5.74±1.05 vs 10.51±1.78,P＜0.01).P02在肝硬化和肝细胞癌中的阳性表达率分别为26.7%和80%,二者之间表达有显著性差异(P＜0.01).结论:CK19可能参与了肝硬化到肝细胞癌的癌变过程.卵圆细胞与肝脏损伤后再生及癌变有关,可能是P02通过促进卵圆细胞的增殖来介导肝细胞癌的发生.
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大鼠卵圆细胞与原发性肝细胞癌发生的关系
目的:研究实验性大鼠肝癌组织中卵圆细胞的病理特点,分布,与肝癌发生发展的关系,以及卵圆细胞对C-kit,PCNA的表达,分布特征,并研究了肝癌发生发展过程中癌基因C-myc的表达变化情况和乌司他丁对C-kit和PCNA的作用.方法:利用诱癌剂DAB喂养SD大鼠来制备肝癌模型.实验设正常对照组,诱癌组,乌司他丁干预组,各组于肝癌开始造模后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 wk分别活杀取肝叶,通过光镜观察在DAB诱癌过程中卵圆细胞的病理分布特点及与对照组和干预组进行比较,同时应用免疫组化和图像分析对C-kit,PCNA阳性细胞进行观察,测定C-mycmRNA的表达.结果:诱癌组和干预组均可见汇管区卵圆细胞增生且逐渐向肝实质内迁移,在癌结节内外都有卵圆细胞分布,免疫组化发现C-kit,PCNA阳性细胞主要为卵圆细胞,分布于汇管区,诱癌组C-myc mRNA的表达量随着肝癌的进展而增高,干预组乌司他丁不能抑制C-myc mRNA升高,但能延迟其的升高.结论:卵圆细胞贯穿于肝癌造模的全过程,对肝癌的发生发展起到重要的作用,C-myc作为一种致癌基因可能是肝癌的启动基因,对肝损伤和肝细胞癌变起重要作用.乌司他丁的干预不能阻止肝癌的发生发展,但能延迟肝癌的发生.
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胆管癌的病因及诊断分析
胆管癌起源于胆管上皮细胞、卵圆细胞或介于两者之间的非上皮性母细胞样细胞,占肝胆系统恶性肿瘤的10%～15%.近年文献显示,其发病率和病死率有逐年升高的趋势.究其原因,与目前缺乏早期诊断胆管癌的手段和对胆管癌发病机制无深入了解有关.为寻求胆管癌发生的高危因素及其诊断,回顾性总结及分析了同济大学附属第十人民医院1983年1月至2004年3月间经病理证实的66例胆管癌临床资料.
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大鼠肝卵圆细胞的分离与鉴定
目的:分离、培养和鉴定大鼠卵圆细胞.方法:以3'-me-DAB刺激卵圆细胞迅速增生,改良梯度离心法分离、培养大鼠卵圆细胞,观察其形态及增值特点并进行细胞免疫组织化学鉴定.结果:改良的梯度离心的方法能够有效地分离大鼠肝卵圆细胞,卵圆细胞胞体为卵圆形,代谢缓慢,具有干细胞的特点,可以形成集落,并且表达OV6、CD34及Nestin.结论:改良梯度离心法分离的细胞具有干细胞的特点,可以表达卵圆细胞特异性的表面标记OV6、造血干细胞表面标记CD34和神经中间丝蛋白Nestin,具有横向分化的可塑性,为进一步实验研究提供参考依据.
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慢性肝损伤时肝内干细胞的增殖
目的:采用免疫组织化学的方法研究慢性肝损伤时肝干细胞在肝脏内的分布和增值,初步探讨肝脏的损伤修复与肿瘤发生的细胞生物学机制.方法:3'-me-DAB喂食大鼠四周,建立应激模型刺激大鼠肝内干细胞的迅速增殖,取材、固定制成石蜡切片,ABC法检测肝干细胞特异性的表面标记蛋白CD34、C-11、CK19、OV6和神经前体细胞的特异性表面标记Nestin在大鼠肝脏内的表达.结果:大鼠肝实质结构改变显著,汇管区内结缔组织细胞大量增生,浸润周围肝组织形成假小叶.靠近界板处断续的排列着卵圆样细胞分别表达CD34、CK19、OV6和Nestin,阳性细胞的形态和分布特点相似,而且具有典型的干细胞的特点.此外,肝实质内可见大量的单个核样干细胞分别表达OV6、CD34、Nestin和CK19.这些细胞类似造血系统来源的单核细胞分布在肝索、肝血窦、肝内血管、增生的小叶间胆管和胆管之间,多见于汇管区的结缔组织内.结论:3'-me-DAB作用后,肝内存在着多种干细胞,而且具有空间分布的规律性.增生的干细胞在损伤应激下继续增殖分化为肝实质细胞,参与肝脏的组织修复,同时成为引发肝脏肿瘤的可能原因之一,具体机制还需要进一步的深入研究.
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肝卵圆细胞来源分化增殖的研究进展
卵圆细胞为肝内一种祖细胞,在肝细胞严重受损或分裂增生受抑制时可向肝细胞和胆管上皮细胞分化,是一种具有双向分化潜能的祖细胞.卵圆细胞的分化增殖受多种因素调控,新近研究认为SDF-1-CXCR4生物学轴在卵圆细胞增殖过程中起非常重要的作用.肝癌的发生与卵圆细胞的分化异常有一定的关系.卵圆细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞使其可能成为肝脏细胞移植的重要细胞来源,在治疗终末期肝病、生物人工肝及基因治疗的研究领域有着广阔的应用前景.
