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IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠细胞外基质积聚的影响
目的: 评价IL-10基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSCs)移植对肝纤维化大鼠细胞外基质(ECM)积聚的影响.方法: 利用免疫磁珠细胞分选(magnetic beadcell sorting, MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1++BDLSCs. 将腺病毒介导的IL-10基因转导至BDLSCs, 采用ELISA法检测IL-10蛋白分泌水平. 将大鼠随机分为4组: 正常组、模型组、BDLSCs组及BDLSCs/IL-10组. 采用PCR法检测Y染色体性别决定基因Sry; 采用VG染色法观测肝组织胶原沉积面积; Western blot法检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin, α-SMA)表达; 采用碱水解法检测肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)浓度; ELISA法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等细胞外基质含量.结果: MASC法能成功分选纯化BDLSCs.IL-10修饰BDLSCs持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外, 移植后能顺利种植于肝内, 减轻胶原沉积, 减少α-SMA表达从而抑制肝星状细胞活化, 与BDLSCs组比较, BDLSCs/IL-10组大鼠肝组织Hyp水平显著降低(255.0±50.5 μg/gvs 373.0±26.7 μg/g, P<0.01), 血清HA, LN及PCⅢ水平也有所降低, 差异具有统计学意义(40.5±7.7 μg/L vs 79.4±10.3 μg/L, 61.5±16.4 μg/L vs 77.7±12.6 μg/L, 14.3±0.8 μg/Lvs 14.9±1.5 μg/L, P<0.01或0.05).结论: IL-10基因修饰BDLSCs移植能有效减少肝纤维化大鼠ECM的积聚, 为治疗肝纤维化提供了新思路.
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骨髓源性肝干细胞的研究进展
近年来干细胞研究取得了很大进展,但是人类胚胎在研究中的应用一直备受争议,因此有关成人体内某些干细胞的受重视程度日益增加.骨髓中的某些干细胞可以演变成为与其组织发育或再生来源无关的细胞类型.卵圆细胞是一种存在于肝脏实质的专能干细胞,研究首先发现了人及动物肝内存在骨髓来源的卵圆细胞,之后体外骨髓干细胞向肝干细胞的成功诱导,使这种现象的存在得到了进一步证实.骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现提示他可能参与了体内肝组织细胞的再生及损伤的修复与替代,并为难治性肝病的治疗提供了新的思路.但是,就目前研究状况而言,许多方面尚存在疑问,骨髓源性肝干细胞的临床应用价值如何还有待于进一步研究.
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骨髓源性肝干细胞的研究进展
骨髓干细胞的横向分化/转分化是近年来研究的热点,骨髓源性肝干细胞是在一定条件下能向肝细胞横向分化/转分化的骨髓干细胞,他的发现为肝病治疗带来了新的希望.近年来对骨髓源性肝干细胞的分化机制、分化环境及条件、分离和培养的研究进一步深入,使其在细胞移植、基因治疗等方面有广阔的前景.现就骨髓源性肝干细胞的研究进展及其在临床治疗中应用前景综述如下.
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人源性细胞大鼠体内移植的实验研究
骨髓内存在能够向肝细胞分化的干细胞的事实已被广泛接受.然而,骨髓源性肝干细胞还不能作为生物人工肝以及肝细胞移植的细胞来源进行临床应用.主要的原因是难以通过骨髓源性干细胞获取足够数量的肝细胞.本实验通过建立肝损伤的大鼠体内微环境,将人骨髓干细胞和人肝细胞系CL-1细胞移植到大鼠肝脏内,试图实现动物肝脏人肝细胞化,获取足够的人源化肝细胞,为临床肝脏移植和生物人工肝治疗提供新的思路.
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转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响
目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响.方法 采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达.体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化.结果 病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少.结论 uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础.
关键词： 尿激酶型纤溶酶原激活物 骨髓源性肝干细胞 肝纤维化 -
肝损伤大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选分化与扩增
目的探讨利用肝损伤早期和淤胆血清培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选、诱导分化和扩增肝干细胞亚群,以快速、高效地获取骨髓源性肝干细胞.方法建立淤胆型肝损伤大鼠模型和制备含5%淤胆血清病理条件培养液,以促进骨髓源性肝干细胞的体内、外筛选和扩增,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养2周时骨髓细胞各种肝干细胞标志表达.结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,细胞表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白.结论淤胆型肝损伤早期大鼠体内环境和含淤胆血清体外病理微环境可能有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞,从而为临床细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞.
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骨髓源性肝干细胞的研究进展
肝干细胞用于肝病治疗的研究日益增多,尤其是骨髓分离骨髓源性肝干细胞.文章就骨髓源性肝干细胞的分离、培养、纯化、诱导分化、检测及肝内移植的可能机制和应用前景进行综述.
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肝干细胞的研究进展
肝干细胞是成体干细胞的一种,由于其具有强大的增殖能力,并能分化为具有功能的成熟肝细胞,为肝病的细胞治疗和组织工程提供了重要的细胞来源.现就肝干细胞的来源、标志物、诱导与示踪、体外培养与扩增、分化及其与肝细胞癌的关系作一综述.
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小鼠骨髓CD90+、CD34+、CD117+和Sca-1+细胞的肝干细胞潜能比较
目的 比较的小鼠CD90+Lin-、C34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能.方法 供体为纯系BALB/C雄性小鼠,应用免疫磁珠分选法获取CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-和Sca-1+Lin-骨髓细胞.受体为35Gy全肝照射处理后的同龄同系BALB/C雌性小鼠,A、B、C、D组小鼠分别接受CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞移植.移植后30天活杀小鼠,取肝进行Y染色体原位分子杂交与白蛋白免疫组织化学联合检测.结果 各组小鼠肝组织中都可以检测到Y染色体和白蛋白均呈阳性的双阳性细胞,C组的双阳性细胞数量显著多于其它各组.结论 CD90+Lin-、CD34+Lin-、CD117+Lin-、Sca-1+Lin-骨髓细胞都具有肝干细胞潜能,其中CD117+Lin-骨髓细胞的肝干细胞潜能大、形成肝细胞的能力量强.
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H3 K27 me2在大鼠骨髓源性肝干细胞分化过程中的变化
目的：研究大鼠骨髓源性肝干细胞（ BMDLSC）向肝细胞诱导分化过程中H3K27二甲基化变化情况，初步探讨H3K27二甲基化与BMDLSC向肝细胞分化过程的关系。方法分离收集大鼠骨髓细胞，通过免疫磁珠分选获得BMDLSC，而后体外诱导其分化为肝细胞，RT-PCR动态检测其白蛋白（ ALB）及甲胎蛋白（ AFP）的mRNA表达水平，通过Western blotting及免疫荧光染色检测第0、7、14天核小体组蛋白H3K27二甲基化的水平。结果分离纯化的BMDLSC在体外诱导分化过程中ALB的表达水平逐渐升高，而AFP的表达水平则先升高后下降；新鲜分离的BMDLSC H3K27无明显甲基化，诱导分化后第7天H3K27二甲基化水平较前升高，第14天进一步升高。结论 BMDLSC经体外诱导后定向分化为肝细胞，在分化过程中H3K27二甲基化水平逐渐升高，H3K27二甲基化修饰变化可能参与BMDLSC细胞向肝细胞分化的调控。
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大鼠骨髓源性肝干细胞脾内移植后的分化
目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞(BDHSC)脾内移植后的分化情况.方法 利用肝细胞生长因子(HGF)体外诱导大鼠BDHSC,并植入60只成年SD大鼠脾内,两组(n=30)分别于术后7天和14天处死动物后取脾,RT-PCR及免疫组化检测移植细胞的AFP及白蛋白的表达.结果 移植后7天,AFPmRNA、白蛋白mRNA和AFP的阳性表达率分别为73.3%、46.7%、56.7%;移植后14天,AFP mRNA阳性表达率(23.3%)显著下降(P<0.01),白蛋白mRNA阳性表达率(20%)显著下降(P<0.05),AFP阳性表达率(26.7%)亦显著下降(P<0.05).结论 体外诱导大鼠BDHSC脾内移植后,其原有的肝干细胞特性逐渐丧失
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腺病毒介导的白介素10基因体外转导大鼠β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞
目的 研究腺病毒介导的白介素10(interleukin 10,IL-10)基因(AdlL-10)体外转导β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞(bone marrow-derived liver stem cell,BDLSC)的可行性.方法 利用免疫磁珠细胞分选(magnetic bead cell sorting,MACS)方法分选大鼠β2m-/Thy-1+BDLSC,RT-PCR法鉴定其肝相关性表型的表达.AdIL-10转导BDLSC,根据腺病毒携带的绿色荧光蛋白表达率测定转导效率,采用RT-PCR法和ELISA法分别检测IL-10的基因表达和蛋白分泌水平.采用MTT法和免疫荧光染色法分别检测腺病毒转导对BDLSC增殖能力和肝细胞样表型白蛋白(albumin,ALB)表达的影响.结果 MASC法能成功分选纯化BDLSC,其在基因水平表达肝细胞样表型.AdIL-10转导BDLSC的效率呈剂量依赖性,佳转染复数为500 pfu/eell.AdIL-10修饰BDLSC高表达IL10基因,且持续高浓度分泌IL-10蛋白至胞外.AdIL-10转导72 h后,BDLSC仍保持正常的增殖能力和ALB表达.结论 BDLSC是AdIL-10转导的适宜载体,为AdIL-10修饰BDLSC这一新型结合方式用于慢性肝病的治疗奠定了实践基础.
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腺病毒介导的人uPA体外转染大鼠骨髓源性肝干细胞的研究
目的评价携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染骨髓源性肝干细胞(BDLSC)的效率,在BDLSC中的表达及其对BDLSC增殖和分化的影响.方法利用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清病理条件培养液筛选和扩增BDLSC,采用荧光显微镜检测AduPA的转染效率,采用Western blotting法检测uPA在BDLSC中的表达,采用MTT法和免疫细胞化学法分别检测转染AduPA的BDLSC的增殖和分化变化.结果随着MOI的增高,转染效率明显增高,当MOI为500时,转染效率达92.6±2.2%,转染3天后的人uPA在BDLSC稳定表达,且转染AduPA对BDLSC的增殖和分化无明显影响.结论BDLSC可能是一种良好的基因载体细胞,可携带uPA用于肝纤维化的治疗研究.
关键词： 尿激酶型纤溶酶原激活物 骨髓源性肝干细胞 肝纤维化 -
骨髓源性肝干细胞和肝病
近年来,随着干细胞研究的热潮,肝干细胞也已成为消化领域中的一个热门课题.肝干细胞可界定为与肝脏胚胎发育和再生有关的各种具有干细胞特性的细胞总称,而并非指某一特定种类的细胞,可分化为具有肝细胞部分或全部表型及功能的细胞是肝干细胞的共同特点.
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自体骨髓源性肝干细胞移植治疗肝炎后肝硬化的临床研究
目的 探索自体骨髓源性肝干细胞在体外诱导与扩增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的效果.方法 选取2008年6月至2009年4月入住我科的肝炎后肝硬化、门脉高压症,并在我科接受了脾切除、门奇静脉断流术治疗的患者12例.治疗组6例,采集并分离自体骨髓源性肝干细胞,在体外培养诱导与扩增7天后,收集细胞在接受脾切除、门奇静脉断流术中经肝固有动脉注入法将其移植至肝内;对照组6例,以同样方法 注入等体积生理盐水.通过术前术后患者肝功能及肝纤维化的指标来评估治疗的效果.结果 两组病人的术后均未发现手术并发症,术前的各项检验均无统计学差异,术后治疗组肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红索、血浆白蛋白、凝血酶原时间;肝纤维化指标:透明质酸、人III型前胶原,均好转:对照组未见明显变化,治疗组优于对照组(P<0.05).结论 自体骨髓肝干细胞体外培养诱导与扩增后肝内移植是一种安全有效的肝病治疗方法 ,可以显著改善肝炎后肝硬化患者肝功能及肝纤维化的指标.
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白细胞介素10基因修饰干细胞移植对肝纤维化大鼠肝脏炎症和肝再生的影响
目的 探讨白细胞介素10(IL-10)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对大鼠纤维化肝脏的炎症反应和肝再生的影响. 方法 雌性Wistar大鼠50只随机分为4组:(1)正常组(10只):皮下注射橄榄油3 ml/kg,2次/周,首剂加倍,共注射8周;(2)模型组(16只):皮下注射体积分数40%CCl_4和橄榄油(CCl_4:橄榄油=2:3),3 ml/kg,注射次数和时间同正常组,于第4周末经门静脉分支输注1 ml无菌等渗盐水(NS);(3)BDLSC组(12只):造模方法 同模型组,于第4周末经门静脉分支输注BDLSC 1 ml(每毫升NS含BDLSC 2×10~5个),后续处理同模型组,(4)BDLSC/IL-10组(12只):造模方法 同模型组,于第4周末经门静脉分支输注IL-10基因修饰BDLSC 1 ml(每毫升NS含BDLSC 2×10~5个),后续处理同模型组.大鼠于造模第8周末处死,留取肝组织备用.采用酶联免疫吸附法检测肝组织IL-10,肿瘤坏死因子α含量,采用苏木素-伊红染色法观察肝组织病理学改变情况;分别采用实时定量PCR法和免疫组织化学法检测肝组织肝细胞生长因子mRNA和增殖细胞核抗原蛋白的表达.根据不同资料采用方差分析或Kruskal-Wallis检验进行统计学分析. 结果 BDLSC能顺利种植于肝内,并至少维持4周.大鼠肝组织的IL-10/TNF α比值,模型组为0.05±0.01,正常组为0.26±0.04(F=57.538,P<0.01),BDLSC/IL-10组为0.68±0.21,BDLSC组为0.08±0.03,模型组比正常组明显降低,BDLSC/IL-10组比正常组明显升高.单纯BDLSC移植未能改善IL-10/TNF α比值降低情况.模型组大鼠肝组织病理学改变明显,炎症反应重,BDLSC组炎症有所减轻,BDLSC/IL-10组的肝组织形态接近正常组.模型组大鼠肝组织的肝细胞生长因子mRNA和增殖细胞核抗原蛋白表达增强,分别为0.0049±0.0009和8511.80±4560.34,F值分别为84.945和82.376,P值均<0.01.BDLSC组二者表达进一步增强,分别为0.0145±0.0022和15 785.21±6431.66,,值分别为84.945和82.376,P值均<0.01,BDLSC/IL-10组较BDLSC组增强更明显,分别为0.0684±0.0190和44 371.43±13 865.65,F值分别为84.945和82.376,P值均<0.01,差异有统计学意义.结论 IL-10基因修饰BDLSC移植能减轻纤维化肝脏的炎症反应,促进肝再生,为有效治疗肝纤维化提供了依据.
