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miR-126基因敲减对小鼠胸腺淋巴细胞发育的影响
目的 研究miR-126基因敲减对小鼠胸腺细胞发育的影响,并初步探讨其意义.方法 观察miR-126基因敲减(KD)小鼠胸腺的体积、重量和细胞总数;Real-time PCR检测小鼠胸腺miR-126表达水平;HE染色观察小鼠胸腺形态学结构;FACS检测胸腺中淋巴细胞比例、核抗原Ki-67的表达以及细胞凋亡的变化;后,Western blot检测胸腺中磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化ERK1/2 (p-ERK)的表达.结果 WT和miR-126KD小鼠胸腺体积大小、重量以及细胞总数均无明显差异,但miR-126KD小鼠胸腺miRNA-126表达水平显著下调(P＜0.05).miR-126KD小鼠胸腺组织结构出现形态学异常.与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠胸腺CD4+ SP细胞比例及细胞绝对数明显增加(P＜0.05),而CD4+ CD8+ (DP)细胞比例及绝对数则显著减少(P＜0.05),miR-126KD小鼠胸腺CD4+ SP细胞核抗原Ki-67表达显著增加(P＜0.05),且细胞凋亡明显减少(P＜0.05),而DP细胞Ki-67表达则明显减少(P＜0.05).后,miR-126 KD小鼠胸腺淋巴细胞中磷酸化AKT和磷酸化ERK1/2的表达水平明显下调(P＜0.05).结论 miR-126基因敲减可显著影响胸腺细胞特别是CD4+ SP细胞的发育,为后续进一步深入探讨miR-126对T淋巴细胞发育以及功能的影响提供重要的实验基础.
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高内涵筛选用于评价新型siRNA运载试剂的细胞群体生物学活性
修饰siRNAs和新型siRNA运载系统对细胞的作用通常通过PCR、Western Blotting和荧光显微镜来进行细胞整体特征的研究.本文报道了基于高内涵、用于siRNA治疗的一种新型运载系统的新策略(CLD),该策略从细胞整体和细胞群体水平综合考虑siRNA的转染效率及对蛋白表达水平的影响.我们证明CLD能达到更佳的细胞摄取,使siBraf达到更好的抗肿瘤活性.该方法具有高效、准确和适用于多个贴壁细胞系的优点,能简化siRNA的研究过程.
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人干扰素结合蛋白35在人巨细胞病毒感染过程中的表达及意义
目的 探讨人干扰素结合蛋白35(interferon-induced protein 35,IFP35)在人巨细胞病毒感染过程中的表达及意义.方法 依据是否感染人巨细胞病毒将血细胞分为感染组和未感染组;根据人包皮成纤维细胞转染siRNA和阴性siRNA分为基因敲减组和阴性对照组;采用SYBRGreen荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和蛋白质印迹法检测不同分组中IFP35的表达量;用人巨细胞病毒感染人包皮成纤维细胞,采用SYBRGreen荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测不同感染复数的人巨细胞病毒感染人包皮成纤维细胞表达IFP35的差异以及相同感染复数的人包皮成纤维细胞感染人巨细胞病毒0、12、24、48、96小时后IFP35表达的差异;敲减IFP35基因后,检测人巨细胞病毒量的变化情况.结果 感染组血细胞中IFP35表达量显著高于未感染组(P<0.05).感染后细胞中IFP35的表达量随人巨细胞病毒浓度的增加而增加,与经感染复数为0的人巨细胞病毒感染后的细胞比较,经感染复数为0.01、0.1及1.0的人巨细胞病毒感染后细胞中IFP35的表达量均显著升高(P<0.05).IFP35的表达量随人巨细胞病毒感染时间的延长而增加,且与0小时相比,其余时间其表达量均显著增加(P<0.05).基因敲减组人包皮成纤维细胞中IFP35的表达水平显著低于阴性对照组(P<0.05).敲减IFP35基因的人巨细胞病毒DNA基因拷贝数较未敲减IFP35基因的人巨细胞病毒显著增加(P<0.05).结论 IFP35的表达量与人巨细胞病毒感染的浓度和时间均呈正相关.IFP35基因的表达可能在一定程度上抑制人巨细胞病毒的感染.
关键词： 人干扰素结合蛋白35 人巨细胞病毒 基因敲减 细胞生长 -
EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达
目的 探讨EB病毒核抗原(EBNA )3C对Gemin3基因表达的影响.方法 共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞.依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响.结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少.结论 EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平.
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microRNA-7基因敲减对小鼠CD4＋SP细胞胸腺发育的影响
目的：研究microRNA-7（ miRNA-7，miR-7）基因敲减对小鼠CD4＋SP细胞胸腺发育的影响。方法：检测miR-7基因敲减（miR-7 knock down，miR-7KD）和野生型（Wild-type，WT）小鼠胸腺重量及细胞总数变化；HE染色观察miR-7KD小鼠胸腺的形态学结构改变；FACS检测胸腺CD4＋单阳性（Single positive，SP）细胞的比例并计算细胞总数，同时检测CD4＋SP细胞CD44及CD62L表达变化；核抗原Ki-67染色法检测CD4＋SP细胞的增殖情况；FACS检测CD4＋SP细胞的凋亡变化；Western blot 技术检测胸腺中总ERK1／2和磷酸化ERK1／2表达水平变化。结果：与WT小鼠相比，miR-7KD小鼠胸腺体积、重量以及细胞总数均显著减少，且形态学结构发生改变（ P＜0.05）；FACS结果显示，miR-7KD小鼠胸腺CD4＋SP细胞比例明显降低，且细胞总数减少（ P＜0.05）。此外，CD4＋SP细胞的CD44表达水平显著增加，而CD62 L表达水平明显减少（ P＜0.05）；同时，CD4＋SP细胞增殖及凋亡比例均显著增加（P＜0.01）；后，miR-7KD小鼠胸腺中ERK1／2以及磷酸化ERK1／2的表达均明显下调（ P＜0.05）。结论：miR-7基因敲减后可显著影响CD4＋SP细胞的胸腺发育，这可能与细胞活化水平及ERK1／2信号通路改变有关。
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慢病毒介导SRB-1受体基因沉默对人脑小胶质细胞吞噬Aβ蛋白能力的影响
目的:利用慢病毒载体筛选人脑小胶质细胞(HM1900)清道夫受体SRB1基因敲减稳定细胞系,检测该细胞系对AD致病蛋白Aβ的吞噬水平变化.方法:采用反转录PCR确认人脑小胶质细胞(HM 1900)SRB1 (GeneID:949)基因表达情况,利用软件设计三组不同序列的针对人SRB1基因的慢病毒shRNA干扰载体,包装为慢病毒感染HM1900细胞,实时荧光定量PCR检测各慢病毒干扰载体的靶基因干扰效率.选用干扰效果佳的RNA干扰慢病毒筛选并获得SRB1基因敲减细胞系,稳定传代后用realtime-PCR检测SRB1受体表达下调情况.通过蛋白内吞实验测定基因敲减后该细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力,与正常小胶质细胞进行比较.结果:利用筛选出的干扰载体完成对HM1900细胞系的SRB1基因敲减,荧光定量PCR检测显示SRB1基因在靶细胞HM1900中表达抑制率达83.7％.蛋白内吞实验显示该基因敲减细胞系对病理蛋白Aβ的吞噬能力下降到对照组的57％(P＜0.05).结论:通过慢病毒载体成功建立SRB1基因稳定敲减的人脑小胶质细胞系,SRB1受体参与了小胶质细胞对病理蛋白Aβ的吞噬及清除过程.
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微小RNA-7敲减对小鼠脾脏中T淋巴细胞体外功能的影响
观察微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(Knock down,KD)对小鼠脾脏T淋巴细胞体外功能的影响并探讨其意义.常规分离野生型(wild type,WT)小鼠脾脏T淋巴细胞,经CD3和CD28抗体刺激后,Real-time PCR检测不同时间点(0h;24h;48h)细胞中miR-7的表达变化;进一步用Con A、CD3和CD28抗体刺激miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞,CCK8检测细胞增殖率;Real-time PCR检测miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10表达的变化;FACS检测CD4+T和CD8+T细胞的数量变化及CD4+T细胞膜分子CD44、CD62L和IL-4、IFN-γ的表达变化.结果显示,WT小鼠脾脏T淋巴细胞活化后,miR-7的表达水平显著上调(P＜0.05);与WT小鼠相比,在Con A、CD3和CD28抗体作用下miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显增加(P＜0.05);miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均明显上调(P＜0.05),而IL-10表达显著下调(P＜0.05);FACS检测结果显示CD4+T细胞比例明显上调(P＜0.05),而CD8+T细胞的比例变化不显著(P＞0.05);CD4+T细胞膜分子CD62L水平显著下降,CD69及IL-4、IFN-γ的表达水平均显著上调(P＜0.05).结果表明,miR-7敲减以后可显著影响小鼠脾脏T淋巴细胞的功能,本实验为后续深入探讨其在T淋巴细胞功能调控中的作用提供实验依据.
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MicroRNA-126基因敲减小鼠腹腔巨噬细胞功能的变化及意义
研究microRNA-126(miR-126)基因敲减小鼠腹腔巨噬细胞的功能变化,初步探讨其意义.采用real-time PCR检测LPS刺激前后野生型(wild type,WT)小鼠腹腔巨噬细胞miR-126表达变化,CCK8法检测其增殖情况;观察miR-126基因敲减(knock down,KD)小鼠腹腔巨噬细胞的形态变化,并用real-time PCR检测miR-126表达变化;CCK8法检测LPS刺激下miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞增殖变化;FACS检测巨噬细胞表面MHCⅡ类分子和CD86分子的表达变化;后,real-time PCR检测巨噬细胞表达炎症因子IL-6、TGF-β和Ⅰ型精氨酸酶(arginase 1,Arg-1)等的变化情况.结果显示,WT小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激后miR-126表达水平下调,显著低于未刺激组(P＜0.05),而增殖能力明显增强(P＜0.05);与WT小鼠相比,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞的miR-126表达量明显下调(P＜0.05);形态上,WT小鼠腹腔巨噬细胞有较长伪足,多呈梭形,而miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞多呈圆形,细胞边缘光滑较少见伪足;LPS作用48h后,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力明显强于WT小鼠(P＜0.05);且其膜MHCⅡ类分子和CD86分子表达也较WT小鼠显著上调(P＜0.05);LPS刺激下,miR-126KD小鼠腹腔巨噬细胞CCL-1表达显著增加,而IL-6、TGF-β和Arg-1的表达水平显著减少(P＜0.05).这些结果提示,miR-126基因敲减可显著影响小鼠腹腔巨噬细胞的增殖能力和功能相关分子的表达,提示miR-126对小鼠腹腔巨噬细胞的功能具有重要的调控作用.
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胰腺癌细胞系PC1.0、PC-1、MEK1/2仓鼠模型的建立及成瘤特性的比较
目的:观察不同肿瘤细胞系在仓鼠体内种植生长的差异,阐明不同胰腺癌细胞系的侵袭转移特性.方法:胰腺癌细胞系PC1.0、PC-1、MEK1/2行仓鼠胰腺原位种植、腹腔注射,建立不同的胰腺癌细胞侵袭动物模型.结果:高侵袭转移PC1.0组在肿瘤组织生长大小、腹水出现情况、肿瘤腹腔转移情况明显高于其他3组细胞;MEK1基因敲减组在胰腺种植、腹腔种植肿瘤组织生长比MEK2基因敲减组生长减小,腹膜及肝脏转移及周围脏器侵袭比MEK2基因敲减组增多.结论:PC1.0肿瘤生长旺盛且转移多;PC-1肿瘤生长一般且转移少;MEK1基因敲减肿瘤生长受抑制,但侵袭转移正常;MEK2基因敲减肿瘤生长不受抑制,但侵袭转移受抑制.
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Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体及其稳定细胞株的构建
目的：筛选并包装Six2基因shRNA敲减的慢病毒，建立稳定表达敲减Six2基因的黑质多巴胺能神经元MES23．5细胞系。方法合成三种（分别命名为pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3）含敲减Six2基因干扰序列的双链DNA oligo，并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的pLV-H1-EF1a载体质粒，均采用慢病毒包装四质粒系统（pRRE/pVSVG/pREV/pLV）包装并转染腺病毒 E1A 基因的人肾上皮细胞系（293T 细胞）以获取慢病毒 pLV-shSix2。收集敲减Six2基因的pLV-shSix2-1、pLV-shSix2-2、pLV-shSix2-3慢病毒质粒及对照质粒上清，感染黑质多巴胺能神经元细胞（MES23．5细胞），分别设为pLV-shSix2-1组、pLV-shSix2-2组、pLV-shSix2-3组及对照组，Western blot法检测各组细胞 Six2蛋白表达，鉴定各组Six2干扰序列的敲减效果。嘌呤霉素法筛选稳定敲减 Six2的MES23．5细胞株。结果酶切结果表明在262 bp及约9000 bp处分别有明显条带，测序结果显示所测序列与敲减的Six2干扰序列完全一致。 Western blot结果显示干扰序列shSix2-2对应的细胞中Six2蛋白表达显著降低，shSix2-1和shSix2-3蛋白表达降低效果不明显。用嘌呤霉素筛选病毒感染的pLV-shSix2-2组细胞系成功。结论成功构建并筛选了Six2基因shRNA敲减慢病毒表达载体，建立了稳定敲减Six2基因的MES23．5细胞株。
关键词： SIX2 胶质细胞系源性神经营养因子 慢病毒 载体构建 基因敲减 -
Gemin3抑制p53介导的细胞凋亡
目的 探讨Gemin3基因表达在细胞增殖中的作用及其途径.方法 采用免疫共沉淀、谷胱苷肽-S转移酶共沉淀实验确定Gemin3与p53两种蛋白在体内、体外相互结合及相互作用的结构域.荧光素酶报告基因检测转染Gemin3基因对p53基因的影响,依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减Gemin3基因的表达并经嘌呤霉素筛选获得稳定的Gemin3低表达细胞系,实时PCR检测Gemin3敲减对p53及其下游基因在转录水平的影响,流式细胞检测Gemin3敲减对细胞增殖的影响.结果 Gemin3的C端与p53的中部DNA结合部位相互结合,Gemin3在转录水平抑制p53基因的表达,敲减Gemin3基因的表达导致细胞凋亡的增加. 结论 Gemin3与p53相互结合并通过抑制p53的表达促进细胞的增殖.
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CRISPR敲减猪CMAH基因的质粒构建及慢病毒的包装
目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装.方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与LentiCRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等质粒用于包装慢病毒.结果:成功构建猪CMAH基因CRISPR-Cas9敲减质粒并包装出相应慢病毒.结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够构建敲减猪CMAH基因的质粒并能够使用其包装出病毒,为后续感染猪动脉内皮细胞(porcine aorta endothelial cell,PAEC)细胞敲减CMAH基因及功能验证奠定基础.
关键词： 慢病毒包装 基因敲减 CMAH基因 CRISPR-Cas9 -
CRISPR-Cas9敲减猪GGTA1基因的质粒构建
目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒.方法:将LentiCRISPR-v2质粒转化感受态DH5α进行扩增并提取该质粒,设计并合成靶向猪GGTA1基因的gRNA(guideRNA,gRNA)序列,对LentiCRISPR-v2质粒进行BsmBI酶切及电泳和胶回收,并将胶回收产物与gRNA序列进行连接,构建LentiCRISPR v2-gRNA重组质粒,将该重组子转化感受态DH5α,培养过夜后,将其涂布于含有氨苄青霉素(Ampicillin,AMP)的LB固体培养基,筛选阳性单克隆DH5α进行培养并提取质粒,对提取的LentiCRISPR-v2-gRNA敲减质粒进行KpnI与EcoRI双酶切验证与序列测定.结果:LentiCRISPR-v2载体酶切结果正确;目的gRNA序列成功插入酶切后的LentiCRISPR-v2载体且序列正确.结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建靶向猪GGTA1基因的敲减质粒,该研究为后续慢病毒的包装及CRISPR-Cas9系统敲减猪GGTA1基因的效率与功能研究奠定了基础.
关键词： 基因敲减 CRISPR-Cas9 GGTA1基因 -
一种新的非Gal异种移植抗原——FAM234A的鉴定
目的 探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原.方法 用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴.将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原.采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量.利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原.结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体.在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少.结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原.
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MicroRNA-7基因敲减小鼠模型的鉴定
目的 鉴定miR-7基因敲减小鼠模型,为进一步研究miR-7的生物学功能奠定基础.方法 常规剪取7只miR-7基因敲减(miR-7 knock down,miR-7KD)小鼠的脚趾和尾巴,分别用来提取基因组DNA和总RNA;剪取1只WT(wild-type,Wr)小鼠的尾巴,提取其总RNA;将提取的两组小鼠的总RNA逆转录成eDNA;分别以基因组DNA和eDNA为模板,用特异性引物PCR技术扩增目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)片段;提取WT和miR-7KD小鼠7个不同组织器官的总RNA,利用Real-time PCR探针法检测各组织器官中miR-7成熟体的表达水平;HE染色观察miR-7KD小鼠心脏、肺脏以及结肠的形态学结构改变.结果 PCR结果显示,模型小鼠的脚趾基因组DNA和尾巴cDNA中均能扩增出载体目的基因EGFP片段;Real-time PCR结果显示,miR-7KD小鼠心脏、肝脏和脾脏等组织器官miR-7成熟体的表达水平较WT小鼠均显著下调(P ＜0.05);HE染色结果显示,miR-7 KD小鼠心脏、肺脏以及结肠形态学结构发生了明显的病理性改变.结论 成功鉴定了miR-7基因敲减小鼠模型,为后续深入探讨该分子的生物学功能提供重要实验基础.
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miR-126敲减增强小鼠CD4+T细胞体内活性并促进其向Th1细胞分化
目的 观察miR-126基因敲减(KD)小鼠体内CD4+T细胞活性的变化并探讨其意义.方法 利用磁珠活化细胞分选技术(MACS)分选miR-126KD小鼠脾脏CD4+ CD62L+T细胞,实时定量PCR检测细胞内miR-126成熟体的表达水平;荧光激活细胞分选术(FACS)检测CD4+T细胞表面活化标志CD69、CD62L和CD44分子以及Ki-67的表达变化;膜联素V/碘化丙啶(annexin V/PI)双染色法结合流式细胞术检测CD4+T细胞的凋亡情况;实时定量PCR检测CD4+T细胞功能相关细胞因子白细胞介素4(IL-4)、IL-10、IL-12、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-o)、γ干扰素(IFN-γ)的mRNA水平变化.结果 与野生型(WT)小鼠组相比,miR-126KD小鼠组CD4+T细胞内miR-126成熟体的表达显著下调;FACS结果显示miR-126KD小鼠CD4+T细胞表达CD62L的比例明显减少,而表达CD69、CD44以及Ki-67细胞的比例显著增加,CD4+T细胞的体内凋亡比例显著减少;CD4+T细胞中IL-4、IL-10的mRNA水平明显降低,而IL-12、TGF-β、TNF-α以及IFN-γ的mRNA水平显著增加.结论 miR-126KD小鼠体内CD4+T细胞的活性显著增强并促进其向Th1细胞分化.
