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低浓度乙醇对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用
目的 探讨低浓度乙醇对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用,及其作用机制.方法 以体外培养的人肝癌HepG2细胞为研究对象,MTT法检测细胞毒性,吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)染色观察细胞凋亡形态,2',7'-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)法检测HepG2细胞内活性氧族(ROS)水平,罗丹明123(Rh123)染色检测线粒体膜电位变化,免疫荧光法检测Caspase-9表达,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 MTT显示,低浓度乙醇呈时间依赖性和剂量依赖性抑制HepG2细胞增殖,1.0、1.6mol/L乙醇作用6h后,细胞内ROS、Caspase-9荧光强度均显著高于对照组(P＜0.01,n=20),Rh123荧光强度显著低于对照组(P ＜0.01,n=20);高内涵活细胞成像系统可见细胞核固缩呈圆珠状凋亡特征;流式细胞术显示,1.0mol/L乙醇作用6h可诱导27.92％ HepG2细胞凋亡,5.4％细胞坏死;1.6mol/L乙醇作用6h可诱导31.22％ HepG2细胞凋亡,15.1％ HepG2细胞坏死.结论 低浓度乙醇可通过升高细胞内ROS水平,降低线粒体膜电位,上调Caspase-9表达,通过线粒体途径诱导HepG2细胞凋亡.
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美伐他汀生物合成基因簇的研究进展
美伐他汀作为第1个被发现的他汀类药物[1],在该类药物的研究开发上占有极其重要的地位.对美伐他汀产生菌的研究可以有效地提高美伐他汀的产量.随着生物技术的发展,采用分子育种技术进行菌株改良,与传统育种方法相比,不仅町提高美伐他汀的产量,更有利于通过对药物合成功能基因的研究,实现由高通量向高内涵筛选的过渡.
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细胞组学技术在心肌细胞凋亡研究中的应用
目的:利用高内涵筛选(high-content screening,HCS)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、激光扫描细胞分析术(laser scanning cytometry,LSC)等细胞组学技术对心肌细胞凋亡特征进行研究.方法:缺氧缓冲液处理H9C2心肌细胞,建立体外心肌细胞凋亡模型,以常规DMEM培养为对照组,处理6h后收取细胞行Annexin V-FITC、PI染色,分别利用HCS和FCM检测,分析心肌细胞早、晚期凋亡以及坏死的比例.利用小鼠心脏左前降支结扎,建立心肌梗死在体模型,术后28d收取心脏,进行TUNEL染色,利用HCS和LSC分析心脏组织健存区、交界区和梗死区心肌细胞的凋亡.结果:缺氧缓冲液处理H9C2心肌细胞6h后,HCS和FCM方法均显示早期凋亡细胞缺氧组与DMEM组,差异有统计学意义,分别为[(17.69±2.85)vs.(5.31±0.86)％,P＜0.01]和[(12.18±0.61)vs.(3.08±0.15)％,P＜0.01],晚期凋亡与坏死细胞比例变化不明显,表明缺氧缓冲液处理6h主要诱导心肌细胞早期凋亡.小鼠心肌梗死28d后,HCS和LSC方法均显示心脏梗死区和交界区有凋亡细胞,梗死区更明显,整体凋亡率分别为6.08％和4.35％,健存区无细胞凋亡.结论:HCS和FCM方法能够可靠、稳定和量化评价心肌细胞凋亡,准确区分细胞早、晚期凋亡和坏死,两种方法结果一致；HCS和LSC方法还可分析组织水平的细胞凋亡；而LSC优势在于可明确凋亡细胞的组织定位.
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细胞组学在新药研发中的应用
细胞组学是近年来发展起来的一种致力于确定单细胞分子表型,进而研究细胞结构及分子功能的科学.其本质是使用高灵敏多参数荧光分析方法整合多种单细胞的不同事件,阐释组织和有机体的复杂事件和行为.借助于快速发展的细胞生物成像和生物信息技术及其高内涵和高通量的分析能力,细胞组学已应用到新药筛选、候选药物优化等新药研发的各个阶段,为高效发现创新药物提供了颇具优势的评价体系.
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基于P-gp功能的多药耐药逆转剂高内涵筛选方法的建立与应用
目的:建立灵敏、快速、稳定的检测P-糖蛋白(P-gP)功能的高内涵筛选模型,寻找高效、低毒的肿瘤多药耐药逆转剂.方法:以荧光探针JC-1在耐药细胞内蓄积实验为基础,建立基于细胞的高内涵筛选模型.结果:JC-1的佳使用浓度为0.5 μmol·L-1,为RHO123浓度的1/10;同时,JC-1染色稳定性好、所建模型Z因子达0.8,明显优于RHO123组.利用该模型筛选获得了多个能抑制P-gp功能的化合物.结论:所建立的P-gP蛋白功能抑制剂高内涵筛选模型具有灵敏、简便与稳定等特点,可用于药物筛选.
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基于诱导多能干细胞的高内涵筛选平台在药物研发中的应用
制药企业药物研发的效率近年来呈逐年下降的趋势,迫切需要更加经济有效的研发平台提高药物研发的成功率.近些年发展起来的诱导多能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞技术已日趋成熟,其与传统药物研发模型相比具有众多优势;高内涵筛选(high content screening,HCS)可以在一次实验中获得大量数据信息,是一项重要的药物筛选和研究工具.本文介绍了结合iPS细胞与HCS技术,应用于药物研发的不同阶段和领域,为新药的研发提供更多的潜能.
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药物筛选技术的新进展--高内涵筛选
化合物活性筛选是创新药物研究过程的起点和具有决定意义的关键步骤.基于细胞的高内涵药物筛选技术实现了对化合物多靶点多参数的同时检测,代表着创新药物研究技术发展的必然趋势,将在未来的新药研发过程中发挥重要作用.笔者介绍了高内涵筛选技术的概念、系统组成,分析了其优势特点,并简要讨论了其在新药研究尤其是抗肿瘤药物研究中的实际应用.
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RNA干扰与高内涵筛选联合应用于药物研发的前景及其挑战
RNAi与高内涵筛选联合应用,可作为药物研发过程中大规模靶标筛选、候选靶标确证的重要方法,还可用于化合物的筛选及作用机制研究;在HCS技术平台上平行进行功能基因组学和化学遗传学研究可同时筛选靶标和先导化合物.RNAi与HCS联合应用在药物研发中显示显著优势的同时,也常被数据的捕获、管理、分析等技术挑战所限制,尤其是海量图像的自动分析,如细胞分界及细胞表型识别分类等.
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藤黄酸的心脏毒性及其基于细胞表型的多指标量化表征
目的：建立基于细胞表型心脏毒性多指标同步量化表征方法，评价广谱抗癌药藤黄酸的心脏毒性。方法采用H9c2心肌细胞系，以多柔比星（Dox）和胺碘酮（Ami）为阳性药对照，1‰DMSO为溶剂对照组，次乌头碱为阴性对照组，应用高内涵分析多通道活细胞成像，收集细胞形态变化以及各指标探针的荧光强度，考察1×10-14～1×10-8mol·L-1浓度范围药物对心肌细胞存活率、细胞核、线粒体形态和功能及胞内钙离子含量的影响，以药物半数有效量（EC50）判断药物对心肌细胞影响程度，以Z′值判断所建方法的精密度和假阳性率。结果 Dox降低细胞数，导致细胞核胀大，线粒体质量增加，EC50分别为0.72，0.014和1.21μmol·L-1，且在浓度为10μmol·L-1时导致胞内钙稳态失衡。Ami导致心肌细胞数下降，细胞核缩小及线粒体质量减少，EC50值分别为14.83，6.72和4.54μmol·L-1，高通量筛选Z′值平均为0.5。次乌头碱对心肌细胞的细胞核和胞内钙离子含量无影响，但改变了线粒体的纹理，纹理分析值降低。藤黄酸对心肌细胞有严重的杀伤作用，使细胞存活率下降，细胞核减小以及胞内钙离子浓度降低，EC50分别为0.24，1.16和0.41μmol·L-1。藤黄酸使线粒体质量降低，线粒体纹理数值降低以及线粒体面积增加，EC50分别为1.21，0.99和0.44μmol·L-1。结论使用高内涵分析多通道活细胞成像技术所评价的阳性药EC50效量和现有报道接近；多指标同步量化对藤黄酸的心脏毒性进行了较为全面的分析，并对其毒性作用机制做出初步的判断。
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毒理学研究的高内涵筛选及其在药物肝毒性研究中的应用
药物性肝损伤(DILI)是导致药物研发终止或从市场撤回的重要原因之一,建立可预测、高通量的临床前检测系统以评估临床潜在的肝毒性是药物研发的迫切需要.基于细胞成像的高内涵筛选(HCS)技术,允许同时检测多个细胞参数,通过实时监测多种信号通路阐明细胞损伤的机制,具有高度的敏感性和特异性.目前已有多种肝细胞模型用于高内涵毒性筛选.本文介绍了HCS技术,回顾了近年来利用高内涵成像技术获得的药物肝毒性资料,探讨了其在肝毒性机制探索中的应用,以及高内涵成像技术在DILI研究中的作用.
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新的蛋白酶体抑制剂YSY-01A对SK-OV-3细胞的周期阻滞作用
化合物YSY-01A是一种新合成的蛋白酶体抑制剂,前期研究已经证实其具有良好的抑制肿瘤增殖作用,但是其作用机制尤其是对细胞周期的阻滞作用仍不清楚.本实验旨在评价YSY-01A的抗肿瘤作用与细胞周期阻滞的关系,并探讨可能的分子机制.结果表明,YSY-01A能够显著抑制卵巢癌细胞SK-OV-3的增殖(P＜0.05),且具有浓度和时间依赖性.进一步实验表明,YSY-01A能够引起SK-OV-3细胞G2/M周期阻滞,显著上调cyclin B1,cdc2和p-cdc2 (T14)等蛋白的表达(P＜0.05); YSY-01A亦可抑制由TNF-α引起的NF-κB核转位,同时上调IκBα、下调IKK和Gadd45α的表达水平.总之,YSY-01A对SK-OV-3细胞具有显著的增殖抑制作用,其分子机制与G2/M细胞周期阻滞有关.
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海洋植物海刀豆紫檀素抑制人肿瘤细胞NF-κB活化所致细胞毒性和凋亡作用研究
从海刀豆中首次分离得到三个已知化合物,(-)-medicarpin(PDl),(-)-2-hydroxy-4,9-dimemoxypterocarpaIl(PD2),4-hydmxy-3-methoxy.8,9-methylene-dioxy-pterocarpan(PD3),并探讨PDl对人肿瘤细胞的细胞毒性和诱导细胞凋亡作用.高内涵筛选分析结果表明,化合物PDl可以抑制NF-κB的活化,诱导细胞核固缩、改变细胞膜通透性与线粒体膜电势,抑制肿瘤细胞增殖.
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高内涵筛选用于评价新型siRNA运载试剂的细胞群体生物学活性
修饰siRNAs和新型siRNA运载系统对细胞的作用通常通过PCR、Western Blotting和荧光显微镜来进行细胞整体特征的研究.本文报道了基于高内涵、用于siRNA治疗的一种新型运载系统的新策略(CLD),该策略从细胞整体和细胞群体水平综合考虑siRNA的转染效率及对蛋白表达水平的影响.我们证明CLD能达到更佳的细胞摄取,使siBraf达到更好的抗肿瘤活性.该方法具有高效、准确和适用于多个贴壁细胞系的优点,能简化siRNA的研究过程.
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基于高内涵技术的20种中药提取物对β淀粉样蛋白致SH-SY5Y细胞损伤保护作用研究
目的 应用高内涵(HCS)技术快速筛选对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)致SH-SY5Y细胞损伤模型有保护作用的中药提取物.方法 选取20种中药饮片,每种药材分别进行20％、40％和95％乙醇提取,以Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞为模型,采用Hoechst33342和PI双染,并利用HCS技术观察60个提取物对模型细胞的保护作用;在此基础上进一步观察活性提取物对模型细胞Caspase-3/7活性的影响,快速筛选对阿尔茨海默病(AD)有潜在治疗作用的中药提取物.结果 HCS筛选发现,在60个提取物中,有17个提取物对模型细胞具有较好的保护作用;进一步研究显示,其中有8个提取物对模型细胞Caspase-3/7活性有较好的抑制作用.并且以刘寄奴40％乙醇部位及丹参20％、40％乙醇部位效果优.结论 以荧光标记为基础的HCS技术是有效、快速筛选对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞损伤模型有保护作用中药提取物的分析方法,筛选出的中药提取物具有潜在的抗AD活性.
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高内涵筛选应用于中药现代化的前景展望
中华医药具有悠久的历史,中国历代中医药学家在防病治病的临床实践应用过程中积累了丰富的经验,并形成了独特的中医药理论体系[1-2].然而中医学发展的道路一直曲折坎坷,曾经甚至面临毁灭的境地,这其中一个很重要的原因就是在西医作为主流医学的今天,中医学缺乏"现代语言"来进行很好的沟通和交流[3].因此,迫切需要应用先进的技术方法来阐述中药复杂的作用机制.
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一种改良的5-羟色胺转运体活性化合物高内涵筛选方法
[目的]建立一种改良的5-羟色胺转运体(SERT)活性化合物高内涵筛选(HCS)方法,包括构建稳定转染hSERT细胞株和优化SERT活性化合物HCS条件.[方法]应用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒hSERT-pcDNA3转染人HEK293细胞,采用遗传霉素(G418)筛选获得稳定转染细胞系,以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)方法分别从转录和翻译水平验证hSERT表达,采用SERT荧光底物4-(4-二甲氨基)苯基-1-甲基吡啶(APP+)在高内涵系统上验证SERT摄取功能并优化其检测条件,应用选择性SERT抑制剂Fluoxetine和SERT增强剂Tianeptine验证SERT HCS方法可靠性.[结果]经PEI转染和G418筛选获得了稳定转染hSERT-HEK293细胞株.与HEK293细胞相比,hSERT-HEK293细胞中hSERT mRNA和蛋白表达量均显著性增加,APP+摄取实验表明hSERT-HEK293细胞摄取ApP+显著性增加,并可被Fluoxetine特异性抑制.实验优化了高内涵检测APP+摄取实验中APP+浓度、孵育时间、数据分析方法等条件.Fluoxetine显著地抑制hSERT-HEK293对ApP+的摄取,Tianeptine显著地增强hSERT-HEK293对APP的摄取,证实此HCS方法的可靠性.[结论]本研究首次优化了应用APP+检测SERT活性的HCS条件,显著提高了SERT荧光检测方法灵敏度,并首次证实此HCS方法适用于SERT促进剂筛选,因此,建立了一种改良的SERT活性化合物HCS方法.
关键词： 5-羟色胺转运体 APP+ hSERT-HEK293细胞系 高内涵筛选 -
针对G蛋白偶联受体的药物筛选新方法
G蛋白偶联受体(GPCR)为具有7个跨膜螺旋的蛋白质受体,是人体内大的蛋白质家族,其为极重要的药物靶点.本文针对GPCR的固有激活和变构效应的药物筛选模型开发新进展和高内涵药物筛选新技术进行综述.
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高内涵筛选结合活细胞实时成像技术分析谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡
目的 利用高内涵筛选(high-content screening,HCS)技术结合活细胞实时成像技术研究谷氨酸诱导的小鼠神经瘤母细胞N2a凋亡的形态学变化特征.方法 用HCS技术分析摸索不同浓度谷氨酸诱导的N2a细胞早期凋亡百分比的变化,同时结合活细胞实时成像技术追踪谷氨酸诱导的N2a凋亡的形态学变化特征.结果 当谷氨酸浓度为750 tμg/mL时,发生早期凋亡的N2a细胞比例达到峰值(42.07％).对同一谷氨酸浓度,随着拍摄追踪时间的增加,凋亡细胞数目逐渐增多,胞核荧光强度的变异系数逐渐增大,胞核面积逐渐缩小,胞核逐渐出现碎片化.结论 使用HCS结合活细胞实时成像技术能直观清晰地捕捉谷氨酸诱导N2a细胞凋亡的形态学变化特征,是一种体外追踪单一细胞凋亡形态学变化的可靠方法.该方法也可应用于药物对细胞凋亡的促进或抑制作用的形态学变化特征的研究.
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新一代分布式计算技术在药物筛选中的应用
概述现代药物筛选方法和新一代分布式计算技术,重点介绍云计算和网格计算技术在药物筛选中的应用,并讨论这些技术在应用过程中存在的问题.药物筛选旨在从大量化合物中发现有活性的化合物,是发现先导化合物和新药的重要途径.药物筛选中数据管理和分析结果为新药研发中先导化合物的发现提供了重要依据.利用新一代分布式计算技术管理和分析实验数据可大大提高效率,降低研发成本、缩短研发周期.
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应用诱导多能干细胞构建体外神经退行性疾病模型的研究进展
随着细胞重编程技术的不断发展,诱导多能干细胞( induced pluripotent stem cells, iPSCs)向不同类型体细胞定向分化的技术已经日趋成熟。由于许多疾病或易感体质具有其独特的遗传信息,因而使用来自具有不同疾病类型的捐赠者体细胞,可以重编程为一系列具有特定致病基因背景的iPSCs库。根据需要可以将其直接分化为能够产生该疾病表征的细胞谱系或亚型。这些细胞由于带有捐赠者的基因特征,因而能够在体外表现出与体内实际病理特征相似的疾病模型。目前已有超过15种此类疾病模型的新药筛选报道。虽然尚不成熟,但我们已经可以预见该方法在药物筛选中巨大的发展潜力。该文总结了以iPSCs作为基础,针对神经退行性疾病所进行的疾病模型的建立。对比传统方法,分析了其在新药高通量筛选( high-throughput screening, HTS)以及高内涵筛选( high-content screening, HCS)中的应用前景。
