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转录因子HOXA5在乳腺癌细胞中的下游信号通路
目的 探究转录因子HOXA5在乳腺癌进展中的作用.方法 构建过表达HOXA5的稳定转染BT549和SUM159细胞系,在稳转BT549细胞系中利用Transwell检测细胞的转移能力;Western blotting检测上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达水平的变化;平板克隆实验检测细胞的增殖能力;转录组测序技术(RNA-seq)进一步分析HOXA5的调控基因,利用软件Cluster 3.0,Tree View和DAVID生物信息数据库(DAVID BioinformaticsResources)以及Enrichr分析京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路,绘制热图(heatmap).结果 BT549细胞系中,稳定转染HOXA5后的实验组细胞迁移能力显著降低(P ＜0.001),且上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平显著上调,间质标志物N-cadherin,Twist1、Slug蛋白表达水平显著下调;平板克隆结果表明,实验组形成的克隆数目明显减少(P＜0.05),克隆大小明显降低.结论 HOXA5通过促进细胞由间质向上皮转化,抑制乳腺癌细胞迁移,并且抑制细胞增殖;HOXA5通过调节糖脂代谢途径调节癌细胞增殖,并且还通过调节细胞运动和黏附相关的基因抑制肿瘤细胞的迁移,通过肿瘤坏死因子(TNF)信号通路发挥抗肿瘤作用.总之,转录因子HOXA5对乳腺癌的发展和恶化起着显著的抑制作用.
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Periostin过表达对鼻咽癌6-10B细胞侵袭和迁移的影响及机制
目的：探讨外源表达periostin蛋白对鼻咽癌（NPC）6-10B细胞侵袭和迁移能力的影响及机制。方法采用脂质体转染技术建立稳定高表达periostin的6-10B细胞，RT-PCR结合Western blotting检测转染效率，Tanswell分析periostin高表达后6-10B细胞侵袭和迁移能力的改变，明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（ MMPs）活性的变化；免疫组织化学检测整合素（integrin）αvβ5在转染periostin前后6-10B细胞中的表达以及其与periostin在鼻咽癌和正常鼻咽黏膜组织中的表达， image-pro Plus 6．0软件进行图像分析及吸光度测定，统计学分析鼻咽癌组织中periostin和integrinαvβ5表达强度的相关性。结果 Periostin过表达的6-10B细胞侵袭、迁移能力明显增强，细胞培养上清中MMP-2、MMP-9活性增加，integrin αvβ5在periostin过表达的6-10B细胞及NPC组织的表达明显强于对照组，Spearman相关性分析显示， integrin αvβ5和 periostin 在 NPC 组织中的表达强度成正相关（ r ＝0．682， P ＝0．000）。结论外源表达periostin能促进NPC的侵袭和转移，其机制可能是通过与NPC细胞膜上integrinαvβ5受体结合而提高MMPs的活性。
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BHD基因在人肺腺癌A549细胞的表达及其对A549细胞转移能力的影响
目的 了解BHD基因在肺癌细胞中的表达部位及其在影响肺癌细胞转移、运动方面的作用. 方法 制备BHD真核表达质粒,转染肺腺癌细胞,用免疫荧光法检测Folliculin蛋白在肺癌细胞中的表达位置;筛选sRNAi片段,选取有效抑制片段转入肺癌细胞,与转入BHD质粒的肺癌细胞对比,用Transwell实验了解BHD基因对肺癌细胞运动方面的影响. 结果 转入BHD质粒后,A549细胞质内出现明显的Folliculin蛋白表达,Transwell实验显示,转入BHD质粒能抑制A549细胞的侵袭能力,而转入BHD siRNA片段的A549细胞运动迁移能力升高.结论 BHD表达产物Folliculin蛋白在肺癌细胞的胞质内表达,BHD可能是肺癌转移抑制基因.
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转录因子 HOXA5在乳腺癌细胞中的下游信号通路研究
目的：：探究转录因子HOXA5在乳腺癌进展中的作用。方法：构建过表达HOXA5的稳定转染BT549和SUM159细胞系,在稳转BT549细胞系中利用Transwell检测细胞的转移能力；Western blotting检测上皮-间质转化( EMT )相关蛋白表达水平的变化；平板克隆实验检测细胞的增殖能力；转录组测序技术(RNA-seq)进一步分析HOXA5的调控基因,利用软件Cluster 3.0,treeview和DAVID生物信息数据库(DA-VID Bioinformatics Resources)以及Enrichr分析KEGG信号通路,绘制热图( heatmap)。结果：BT549细胞系中,稳定转染HOXA5后的实验组细胞迁移能力显著降低( P<0.001),且上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平显著上调,间质标志物 N-cadherin, Twist1,Slug蛋白表达水平显著下调；平板克隆结果表明,实验组形成的克隆数目明显减少( P<0.05),克隆大小明显降低。结论：HOXA5通过促进细胞由间质向上皮转化,抑制乳腺癌细胞迁移,并且抑制细胞增殖；HOXA5通过调节糖脂代谢途径调节癌细胞增殖,并且还通过调节细胞运动和粘附相关的基因抑制肿瘤细胞的迁移,通过肿瘤坏死因子( TNF)信号通路发挥抗肿瘤作用。总之,转录因子HOXA5对乳腺癌的发展和恶化起着显著的抑制作用。
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Transwell模拟腹膜透析屏障及相关研究进展
Transwell既是一种试验装置,也是一种试验技术.在模拟生物屏障方面,研究较多较成熟的有血脑屏障、肠粘膜屏障、血视网膜屏障、胎盘屏障和腹膜透析屏障.本文将针对腹膜透析屏障的建立、验证及应用该屏障的相关研究做一全面的阐述.
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Transwell侵袭实验测定M受体对胆管癌细胞侵袭的影响
目的 探讨Transwell体外侵袭模型适用于胆管癌侵袭性研究的实验条件和方法.观察M受体兴奋剂及拈抗剂对胆管癌侵袭力的影响.方法 将不同浓度(0.5×105/mL、1.0×105/mL、1.5×105/mL、2.0×105/mL)的胆管癌细胞200μL置入Transwell小室侵袭模型,分别培养12 h、24 h、36 h、48 h,观察不同浓度细胞在不同时间穿透基质凝胶多空滤膜的细胞数.选取适浓度的胆管癌细胞与匹罗卡品共同加入 Transwell 的上室,调整小室内匹罗卡品浓度分别为0 mmol/L、0.1 mmol/L、
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人类胃癌细胞高侵袭亚系的筛选及其生物学特性研究
目的 采用Transwell小室筛选胃癌细胞高侵袭亚系并研究其生物学特性.方法 利用Transwell小审筛选高侵袭力胃痛细胞亚系,通过HE染色、Western blotting、Transwell小室模型、免疫组织化学法及生长曲线研究亚系的生物学特性.结果 利用Transwell小室反复筛选10次,从MKN-28细胞中筛选出高侵袭力胃癌细胞亚系MKN-28S10.母亚两系细胞形态上无明显差异,但亚系中E-cadherin和TIMP-1蛋门表达同母系相比显著降低(P<0.05),显微镜下细胞计数示亚系迁移至膜背面的数量(100.25±0.50/视野)较母系(61.75±2.06/视野)明显增多(P<0.05),细胞运动能力明显增强;免疫组织化学结果显示,亚系中NM23-H1的表达明显低于母系(P<0.05);亚系体外生长速度快于母系.结论 MKN-28S10细胞较MKN-28细胞具有更高侵袭力和更强增生能力.
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胶质瘤中变异型IκBα的表达与抑制肿瘤浸润的研究
目的 探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type PA,uPA)和其受体(uPA-receptor,uPAR)表达的调控作用及其与肿瘤浸润行为的关系.方法 构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株;用Transwell法测定肿瘤细胞的迁移能力;RT-PCR技术检测细胞内uPA、uPAR在RNA水平的表达;制作裸鼠皮下异位移植瘤生长模型,并采用免疫组化法分析肿瘤组织中uPA和uPAR的表达.结果 Transwell法测定G36△-M组肿瘤细胞的迁移能力明显降低;RT-PCR及肿瘤组化染色结果显示,uPA和uPAR在G36△-M组中的表达显著低于G36△、G36△-W和G36△-P三组,而在后三组间的表达无统计学意义.结论 IκBαM基因在RNA和蛋白水平均可显著降低人类恶性胶质瘤中uPA和uPAR的表达,进而减弱肿瘤细胞的浸润能力,抑制肿瘤组织的浸润.
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ANXA2、VEGF在HepG2肝癌细胞系中的表达及意义
目的 探讨ANXA2、VEGF在HepG2肝癌细胞系中的表达及意义.方法 应用Transwell(细胞体外侵袭实验)、WesternBlot检测在不同5-Fu剂量干扰下,HepG2肝癌细胞系中ANXA2、VEGF的表达及细胞侵袭力的变化.结果 Transwell检测HepG2肝癌细胞随着5-Fu剂的增加侵袭力明显降低,各剂量组间差异具有统计学意义(P＜0.05);WesternBlot方法检测HepG2肝癌细胞中ANXA2、VEGF蛋白质的表达随着5-Fu剂量的增加逐渐下降,各剂量组间差异具有显著统计学意义(P＜0.01),且两者具有相关性r=0.856.结论 ANXA2、VEGF在HepG2肝癌细胞系的侵袭转移机制中可能具有协同促进作用.
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TGF-β1调控MAP1S通过NER信号通路影响肺癌细胞的增殖和侵袭
目的 探讨TGF-β1调控MAP1S通过NER信号通路影响肺癌细胞的增殖和侵袭.方法 免疫组化检测肺癌和正常肺组织中TGFβ1和MAP1S的表达情况;免疫共沉淀实验检测TGFβ1和MAP1S蛋白的相互关系;MTT实验检测沉默MAP1S后肺癌细胞增殖能力的变化;Transwell试验检测沉默MAP1S后肺癌细胞侵袭能力的影响;Western blotting检测沉默MAP1S后ERCC1和ERCC3蛋白的表达情况;裸鼠体内成瘤实验检测沉默MAP1S后肺癌细胞成瘤能力变化.结果 与正常肺组织相比,肺癌组织中TGFβ1和MAP1S表达水平明显升高;免疫共沉淀实验表明TGFβ1和MAP1S结合为共同体;沉默MAP1S抑制肺癌A549细胞的增殖和侵袭能力、下调ERCC1和ERCC3蛋白的表达、抑制肺癌A549细胞的体内成瘤能力.结论 TGFβ1和MAP1S在肺癌中表达明显升高,同时沉默MAP1S可以抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力,TGFβ1可以靶向MAP1S蛋白通过NER信号通路调控肺癌细胞的生物学行为.
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miR-26调控BID蛋白对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 探讨miR-26对BID蛋白的调控作用及在结肠癌细胞中对其增殖和侵袭能力的作用.方法 qPCR检测结肠癌组织和结肠癌细胞中miR-26的表达情况;观察miR-26和结肠癌临床病理分期之间的关系;免疫荧光检测miR-26-inhibitor在结肠癌细胞中的转染效率;双荧光素酶实验检测miR-26和BID的关系;MTT实验检测沉默miR-26对结肠癌细胞增殖能力的影响;Transwell侵袭实验检测沉默miR-26对结肠癌细胞侵袭能力的影响;结果 miR-26在结肠癌组织中表达水平较高;随着结肠癌的病理分期升高,miR-26的表达相应升高;沉默miR-26可以有效上调BID的表达;沉默miR-26可以抑制结肠癌细胞的增殖侵袭能力.结论 miR-26在结肠癌中表达上调,同时miR-26可以调控BID的表达影响结肠癌细胞增殖和侵袭能力.
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大鼠肺微血管内皮细胞通透系数检测的方法
目的 探讨肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透系数检测的实验方法。方法 分别在trans well 小室和聚碳酸酯纤维膜上构建大鼠PMVEC单层模型，用电阻抗仪和倒置显微镜观察到细胞单层汇合后，分别应用电阻抗仪监测跨内皮细胞电阻(TER)，用异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖法检测通透系数(Pd)，用Hanks平衡液法检测通透系数（Lp）;同时观察脂多糖(LPS)刺激0.5h和2h后的PMVEC通透性变化，以测量值与其相应静息状态值的比值表示。结果 倒置显微镜下观察到细胞接种后3d时已汇合成单层时TER值为(39.45±3.96)Ω．cm2，Pd值为(8.52±0.50)×10-6 cm/s；随细胞接种时间增加，TER值稳定升高，接种后4d达高峰[(49.84±3.93)Ω．cm2]。静息状态下汇合成PMVEC单层的TER值、Pd值和LP值分别为(49.84±3.93) Ω·cm2、(6.15±0.63)×10-6 cm/s和(6.80±0.62)×10-7 cm．s-l．cm H2O-l。与未刺激组比较，10 mg/L LPS刺激PMVEC 0．5 h和2h后，TER法测定的通透性均下降（0.87±0.03、0.45±0.04比1．00±0.08），Pd法和Lp法测定的通透性均增加(Pd:1.33±0.11、2.43±0.14比1．00±0.10;Lp:1.30±0.07、2.38±0.15比1．00±0.11)，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 TER法、Pd法和Lp法均能有效检测PMVEC通透系数，倒置显微镜联合TER和Pd法所测值更加精确，从而为体外研究急性肺损伤发病机制提供实验方法。
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直接和间接共培养条件下小鼠子宫自然杀伤细胞与树突状细胞相互作用的比较
背景:子宫自然杀伤细胞与树突状细胞可以相互作用,但相互间作用是否必须直接接触还存在不同的观点.目的:对比直接和间接共培养条件下子宫自然杀伤细胞与树突状细胞之间的相互作用,明确两者相互作用的方式.方法:将树突状细胞和子宫自然杀伤细胞进行直接接触共培养,设为直接共培养组;在2种细胞Transwell系统中进行共培养,设为间接共培养组.观察培养细胞的生长状况,酶联吸附法检测培养上清白细胞介素10,12、转化生长因子β细胞因子的浓度,流式细胞术检测各组细胞表面标志CD86的表达情况.结果与结论:与单独培养树突状细胞和子宫自然杀伤细胞相比,直接和间接共培养组培养液上清中白细胞介素10,12、转化生长因子β浓度均增加(P < 0.05),尤以白细胞介素10浓度增加明显(P < 0.05),CD86的表达明显增高 (P < 0.05).直接共培养组白细胞介素10,12和转化生长因子β浓度更高(P < 0.05),表达CD86的细胞含量更多 (P < 0.05).证实子宫自然杀伤细胞可以促进树突状细胞成熟,而树突状细胞促进子宫自然杀伤细胞的分泌,两者通过细胞间的直接接触而相互作用.
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微孔膜法比较Stro-1+和Stro-1-间充质干细胞的免疫调节作用
背景:研究表明间充质干细胞对淋巴细胞的增殖具有免疫抑制效应.但间充质干细胞是非均一性的细胞群,Stro-1+的抑制效应显著强于Stro-1-间充质干细胞.目的:评估Stro-1+和Stro-1-间充质干细胞对淋巴细胞增殖抑制效应的显著差异在间充质干细胞与淋巴细胞非直接接触的情况下是否依然存在.方法:先将1×104,3×104 Stro-1+或Stro-1-间充质干细胞加入微孔膜培养板(Transwell)的下室,一两小时待细胞贴壁后,再将1×104反应性外周血淋巴细胞和等量经照射的刺激性外周血淋巴细胞加入培养板的上室进行共孵育.培养5 d后以3H-TdR掺入率检测外周血淋巴细胞的增殖情况.对照组为间充质干细胞与淋巴细胞直接接触的培养体系.结果与结论:在间充质干细胞与淋巴细胞直接接触的条件下,Stro-1+间充质干细胞对淋巴细胞增殖的免疫抑制效应显著强于Stro-1-间充质干细胞;当使用微孔膜培养板阻断间充质干细胞与外周血淋巴细胞的直接接触时,这一免疫抑制作用的显著差异则消失,并且不论是Stro-1+还是Stro-1-间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制作用均显著弱于各亚群与外周血淋巴细胞直接接触的情况.提示间充质干细胞与淋巴细胞的直接接触是间充质干细胞的免疫调节效应得以发挥的主要因素,而某些可溶性因子在此过程中的作用只占小部分;细胞间的这种"直接对话"也是Stro-1+间充质干细胞优势性免疫调节作用得以发挥的前提.
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CXCR4在不同转移潜能肝癌细胞中的表达及意义
目的 研究趋化因子受体CXCR4在高、低转移潜能肝癌细胞中的表达,并探讨其在肝癌细胞增殖和侵袭转移过程中的作用.方法 利用3B肝癌细胞株对人工基底膜穿透能力的差异获得不同转移潜能肝癌细胞亚系,并通过Transwell小室侵袭实验比较两细胞亚系的侵袭能力从而对其进行验证,应用RT-PCR和Western blot检测CXCR4在两细胞亚系中的表达.CCK8法检测两细胞亚系生长曲线和倍增时间,流式细胞仪检测两细胞亚系细胞周期和凋亡率.结果 成功筛选出高、低转移潜能肝癌细胞亚系,并通过Transwell小室侵袭实验证实高转移潜能肝癌细胞的侵袭能力高于低转移潜能肝癌细胞；RT-PCR和Western blot均显示高转移潜能肝癌细胞在基因水平和蛋白水平的CXCR4表达均显著高于低转移潜能肝癌细胞；且两细胞亚系体外生长速度、倍增时间、细胞周期和凋亡率差异均具有统计学意义.结论 上述结果表明CXCR4在肝癌进展中发挥重要的作用,可能为未来肝癌的诊疗提供理论依据.
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小鼠窦前卵泡与卵泡膜间质细胞的3种共培养方法比较
目的:探索小鼠窦前卵泡与卵泡膜间质细胞体外共培养的佳模型.方法:分别从14～ 16日龄和21 ～25日龄C57BL/6小鼠中分离得到窦前卵泡和卵泡膜间质细胞,采用海藻酸钠凝胶法、Transwell间接、直接接触法体外共培养6天,比较各组卵泡形态、生长发育、激素分泌、存活率、卵母细胞成熟阶段.结果:海藻酸钠凝胶中培养的卵泡能够维持其三维结构,观察更清晰,而Transwell中培养的卵泡更有利于颗粒细胞的增殖,第5天时卵泡直径超过三维培养,雌二醇分泌水平与卵泡的生长模式相一致.第5天时海藻酸钠凝胶法(77.3％)和Transwell直接接触法(76.5％)的卵泡存活率要明显高于Transwell间接接触法(57.4％),P ＜0.05.3种方法的卵母细胞减数分裂恢复能力间无明显差异.结论:短期(5天内)的体外共培养可以选择Transwell直接接触法,而更长时间的共培养则推荐海藻酸钠凝胶法.
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CD4+CD25+调节性T细胞对内皮细胞抗原提呈功能的影响及机制
目的:探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)对内皮细胞抗原提呈功能的影响及机制.方法:磁性细胞分离器(MACS)分离CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞.在ox-LDL作用下,HUVECs与CD4+CD25+T细胞共培养,24小时后收集HUVECs.应用流式细胞术测定HUVECs抗原提呈分子(HLA DR,CD86,CD80)的表达,Cell Counting Kit-8法(CCK-8) 测定HUVECs刺激CD4+CD25- T细胞增殖的能力,Transwell小室实验初步探讨Treg作用于HUVECs的具体机制.结果:与对照组比较,Treg可显著抑制HUVECs抗原提呈分子的表达及刺激T细胞增殖的能力.用Transwell隔离后,与or-LDL刺激组比较,HUVECs抗原提呈分子表达及其刺激T细胞增殖的能力无明显变化.结论:Treg可显著抑制HUVECs抗原提呈能力,其作用机制可能为下调CD86的表达,且依赖细胞直接接触.
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miR-34a通过Snail诱导肺癌EMT及促进其转移的分子机制
目的:探讨miR-34a在肺癌组织中的表达情况以及miR-34a在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制.方法:qPCR检测肺癌和正常肺组织中miR-34a的表达情况;使用miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor过表达和沉默miR-34a,qPCR检测沉默和过表达效果;Western blot检测沉默和过表达miR-34a后Snail蛋白的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-34a与Snail的相互作用;Transwell侵袭实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞迁移能力的影响;Western blot检测E-Cadherin、Vimentin和Twist蛋白的表达情况.结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中miR-34a表达明显降低;且晚期、低分化和有淋巴结转移的肺癌组织miR-34a表达明显较早期、高分化和无淋巴结转移的肺癌组织低;miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor可以有效抑制和过表达miR-34a的表达;miR-34a能与Snail的3′ UTR特异性结合;miR-34a可以调控肺癌H1650细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-34a上调E-Cadherin,同时下调Vimentin和Twist蛋白的表达,沉默miR-34a则相反.结论:miR-34a在肺癌中表达明显降低,且跟肺癌分期分级以及淋巴结转移与否密切相关,同时miR-34a可以通过上皮间质转化调节肺癌细胞侵袭和迁移能力.
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miR-143调控PAN3蛋白的表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭和迁移的影响
目的:探讨miR-143调控PAN3蛋白的表达对B细胞淋巴瘤细胞侵袭和迁移的影响.方法:运用qPCR实验检测miR-143在正常骨髓组织和淋巴瘤血液组织中的表达情况;检测在不同种类的细胞株中miR-143的表达水平;qPCR检测miR-143对PAN3的表达水平的影响;双荧光素酶实验检测miR-143和PAN3之间的相互关系;划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-143表达对B细胞淋巴瘤E6-1细胞迁移和侵袭能力的影响.结果:和正常骨髓组织相比,miR-143在B细胞淋巴瘤中表达明显下调;选取miR-143表达水平较低的E6-1细胞株;双荧光素酶实验表明miR-143可以下调PAN3的表达水平,直接影响PAN3的表达活性;过表达miR-143后,E6-1细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制,抑制E6-1细胞的侵袭转移能力.结论:miR-143可以通过调控PAN3的表达,从而调节B细胞淋巴瘤细胞的迁移和侵袭行为.
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BCYRN1调控miR-503通过Notch1信号通路对肺癌迁移和侵袭的影响
目的:探讨BCYRN1调控miR-503通过Notch1信号通路对肺癌迁移和侵袭的影响机制.方法:qPCR检测不同肺癌细胞株中BCYRN1和miR-503的表达情况;免疫荧光和qPCR检测慢病毒BCYRN1+siRNA转染肺癌细胞的转染效率;双荧光素酶报告基因检测BCYRN1与miR-503的相互作用;Transwell侵袭实验和划痕实验检测沉默BCYRN1后肺癌细胞侵袭和迁移能力的变化;Western blot检测沉默BCYRN1后Notch1信号通路蛋白的表达情况;裸鼠皮下成瘤检测沉默BCYRN1后肺癌细胞裸鼠体内成瘤能力的影响.结果:在肺癌细胞H1299中BCYRN1表达水平高,miR-503的表达水平相对较高;免疫荧光及mRNA水平证明BCYRN1+siRNA慢病毒可以有效转染进入H1299细胞内;BCYRN19能与miR-503的3′-UTR特异性结合;沉默BCYRN1可以抑制肺癌H1299细胞的侵袭和迁移能力;沉默BCYRN1后Notch1通路蛋白表达情况相应下调;与NC组相比,BCYRN1-siRNA组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量都明显减小.结论:BCYRN1可以靶向调节miR-503通过Notch1信号通路影响肺癌H1299细胞的侵袭和迁移能力.
