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HCMV编码的dsRNA结合蛋白在抗机体RNA干扰中的作用
人巨细胞病毒(HCMV)是一种感染广泛的疱疹病毒家族中的一员,它对人群中的易感者尤其对免疫能力下降患者的危害已引起社会的广泛重视.RNA干扰(RNAi)是近年来发现存在于体内抵御病毒感染和基因损伤的一种重要的保护机制.而HCMV则可通过编码dsRNA结合蛋白(DRBPs),特异性结合dsRNA,阻断宿主细胞抗病毒的RNAi途径,保护病毒mRNA的表达,终达到逃避宿主细胞的抑制病毒转录的作用.
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RNA干扰--治疗HIV感染的新方法
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的,特异性沉默内源或外源性同源基因的过程.RNAi的分子生物学特征当前已被用于抗HIV感染和治疗AIDS病.本文就RNAi抗HIV机制和近两年来RNAi在抗HIV-1感染方面的新研究进展及在RNAi实验设计上需注意的问题等方面加以综述.
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RNA干扰技术及其在环境基因交互作用研究中的应用
自RNA干扰现象发现以来,RNA干扰技术的研究日益深入,随着人类基因组测序的基本完成及一系列组学概念的提出,RNA干扰技术在各个学科和领域的应用日渐广泛,并与其他分子生物学技术相结合,在基因功能研究方面发挥着巨大的作用.尤其是随着此项技术在哺乳动物细胞中应用的深入研究,以及和微阵列技术的结合使用,使其能在哺乳动物中进行高通量的基因功能研究,这就为研究人类生存环境与人类基因交互作用提供了有力的技术支持.本文就此项技术近年来在环境基因交互作用研究中的应用现状、应用中的关键问题以及应用的前景作一简述.
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钙调神经磷酸酶Aβ小干扰RNA筛选及对心肌细胞肥大的抑制
目的 在细胞水平上筛选钙调神经磷酸酶(CaN)Aβ基因(mRNA)的小干扰RNA (siRNA)的干扰序列,为研究抑制在体心肌肥大的方法提供理论基础.方法 针对CaN Aβ mRNA,参照siRNA设计原则,应用软件设计候选干扰序列,构建相应的小发夹RNA表达载体(si1053,si 1280,si1539).培养乳鼠心肌细胞,分为6组:空白对照组,肥大模型组(醛固酮诱导),肥大+si 1280组,肥大+si1539组,肥大+si1053组,肥大+siGFP阴性对照组(转染针对GFP特定序列的shRNA质粒).48h后显微镜下测量心肌细胞直径、CaN Aβ及心房利钠因子(ANF)、β-重链肌球蛋白(β-MHC)mRNA水平.结果 肥大模型组心肌细胞直径以及心肌组织CaN Aβ、ANF、β-MHC mRNA表达水平较空白对照组明显增加(P＜0.05).肥大+si1053、肥大+si1280、肥大+si1539组细胞直径以及CaN Aβ、ANF mRNA水平均较肥大模型组及肥大+siGFP阴性对照组降低(P＜0.05),3组之间的CaNAβmRNA水平无明显差异(P＞0.05),其中肥大+si1280组的细胞直径、ANF及β-MHC mRNA水平较肥大+si1053组、肥大+si1539组有明显减低(P＜0.05).结论 成功构建CaN Aβ mRNA的小发夹RNA表达质粒,siRNA抑制CaN Aβ mRNA的表达,可抑制细胞水平醛固酮诱导的心肌细胞肥大；其中1280(21 bp)为RNA干扰的相对更有效片段.
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乙肝病毒P基因siRNA对小鼠体内HBVP基因表达的抑制
目的:检测乙肝病毒P基因siRNA(small interfering RNA)对小鼠体内HBVP基因在体内的表达抑制作用.方法:利用尾静脉高压法把PUC-HBV2质粒和siRNA一同转入动物体内,使用乙肝检测试剂盒检测HBsAg的含量.结果:动物实验表明,4.0μg的siRNA体内抑制率达80%.结论:siRNA能够有效的降低HBVP基因的表达.
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可控性Speedy A基因表达转基因小鼠模型的建立鉴定和表型分析
目的 建立基于Tet-On系统诱导表达的Speedy A基因RNA干扰转基因小鼠模型,探讨Tet-On系统在研究精子发生相关基因中的应用,研究SpeedyA基因下调对精子发生的影响. 方法 体外实验筛选下调SpeedyA基因表达的有效干扰片段,Gateway技术构建包含有效干扰片段和四环素反应元件(TRE)的质粒(pRP.EX2d-TRE＞ shSpdya),受精卵显微注射该质粒建立转基因小鼠并筛选到纯合子,然后与四环素调控的反式激活子(rtTA)转基因小鼠杂交,筛选TRE和rtTA双阳性的小鼠为四环素诱导的SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,喂食强力霉素(Dox)诱导RNA干扰片段的表达下调SpeedyA基因的表达;实时荧光定量PCR法检测模型组小鼠与喂食强力霉素的正常小鼠(对照组)SpeedyA的表达差异;HE染色观察睾丸组织形态学变化,TUNEL法检测小鼠睾丸组织的细胞凋亡情况. 结果 模型组小鼠Speedy A基因的表达量与对照组小鼠的表达量相比下降26％;模型组小鼠睾丸组织发生异常的生精细胞凋亡. 结论 成功建立了基于Tet-On系统诱导表达的可控性SpeedyA-RNA干扰转基因小鼠模型,说明可以基于Tet-On系统在体研究精子发生相关基因的功能;SpeedyA基因表达下调可使生精细胞发生异常凋亡.
关键词： TET-ON系统 Speedy A基因 RNA干扰 精子发生 -
RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌细胞生长的抑制作用
目的 探讨RNA干扰沉默STAT3基因表达对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用.方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建重组质粒(pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3),转染SKOV3细胞进行体外研究;采用Western blot、实时聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学技术检测重组质粒对STAT3基因表达的作用;MTT法检测重组质粒对SKOV3细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导的细胞凋亡.结果 (1)免疫组织化学技术证实卵巢癌细胞株SKOV3及癌组织中STAT3呈高表达;(2)成功构建pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒,并成功转染SKOV3细胞;(3)MTT法证实重组质粒抑制SKOV3细胞的增殖,流式细胞技术证明重组质粒诱导细胞凋亡;(4)RT-PCR与Western blot分析表明,重组质粒在mRNA及蛋白质水平特异的抑制STAT3的表达;(5)STAT3基因表达的下调抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结论 pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡.
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真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究
目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段(2,061 bp),并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3'端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.
关键词： CatSper1基因 RNA干扰 共转染 -
RNA干扰沉默酸性鞘磷脂酶1基因对人成纤维细胞凋亡的影响
目的 为研发保护女性生殖细胞的小分子干扰RNA(siRNA)类药物,以人包皮成纤维细胞(HFF)为模型,检测靶向凋亡关键基因酸性鞘磷脂酶1(SMPD1)基因的siRNA对HFF凋亡的抑制作用.方法 设计合成三对靶向SMPD1基因的siRNA并体外转染HFF细胞,转染后48 h用丝裂霉素(MMC)诱导细胞凋亡.荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Q-RT-PCR)法及免疫印迹(Western blot)检测siRNA转染后SMPD1在mRNA水平和蛋白水平的变化,Annexin Ⅴ-PI双染检测细胞凋亡率.用脂质体(lipofectamine 2000)和无干扰siRNA(NT siRNA )作为对照.结果 siRNA1、2、3对SMPD1基因mRNA的抑制效率分别为(67.0±9.0)%、0%、(45.0±2.1)%,以siRNA1高,蛋白水平的抑制也呈现相同变化.siRNA1组细胞凋亡率为15.2%,明显低于MMC组(26.3%).结论 靶向SMPD1的siRNA可以抑制人包皮成纤维细胞凋亡.
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用于基因治疗的APRIL-siRNA/类脂质体复合物短期实验
目的 检测APRIL-siRNA/类脂质体复合物的亚急性毒性,以期为APRIL-siRNA/类脂质体复合物这种新基因治疗药物今后合理应用于临床提供依据.方法 40只ICR小鼠,随机分为4组.试验组设低、中、高3个不同剂量组,分别为APRIL-siRNA/类脂质体复合物125、250和500 mg/kg·bw,和1个对照组(生理盐水).按0.1 ml/10 g·bw小鼠每天静脉注射(iv)1次,连续14 d.分别于染毒前、染毒后第1、3、5、7、9、11和14天定期称重小鼠体重和食用饲料重量.小鼠于染毒后第14天,iv给予3％戊巴比妥钠麻醉,心脏取血,检测血液学指标和血液生化学指标；迅速取出主要脏器,进行称重并做病理组织学检查.结果 各组APRIL-siRNA/类脂质体复合物试验组体重变化、进食量、脏器系数与病例切片结果与正常对照组相比,除了试验组脾脏重量与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05),其余均无统计学意义(P＞0.05).结论 在本实验剂量范围内,APRIL-siRNA/类脂质体复合物对小鼠亚急性毒性试验无明显毒性反应.
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Caspase-3 shRNA对染铝神经细胞凋亡的干预
目的 通过体外实验来研究铝的神经毒性,探讨慢病毒载体Caspase-3 RNA于扰对染铝神经细胞凋亡的干预效果.方法 原代培养神经细胞,用AlCl3·6H2O染毒,选用病毒为载体的Caspase-3 shRNA试剂感染神经细胞,荧光标记感染成功的细胞计算神经细胞的感染效率,荧光定量PCR技术检测干预后Caspase-3基因的表达情况计算慢病毒载体的Caspase-3 shRNA的抑制率.光学显微镜、荧光染色观察神经细胞的形态学变化,并检测细胞活力；AnnexinV-PI双染法检测神经细胞感染后的凋亡坏死率.结果 慢病毒载体的Caspase-3 RNA干扰试剂的感染效率大于90％,抑制率为66.47％.用慢病毒载体的Caspase-3 shRNA感染原代培养神经细胞后可见染铝神经细胞活力显著上升(P＜0.01);吖啶橙(AO)-溴化乙啶(EB)双荧光染色法可以清楚地观察到染铝细胞的早期凋亡和晚期凋亡现象明显减少;Annexin V-PI双染法检测结果显示,感染后染铝神经细胞凋亡率显著降低(P＜0.01).结论 馒病毒载体的Caspase-3shRNA感染细胞后,可以显著抑制Caspase-3基因的表达,神经细胞活力明显增高,凋亡细胞的数量显著降低.
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X线修复交叉互补基因1缺陷细胞株的建立及其蛋白的表达
目的 运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人X线修复交叉互补基因1(XRCC1)在支气管上皮细胞中的表达,为研究人XRCC1蛋白在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备.方法 利用分子克隆技术构建含pU6启动子的XRCC1 RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-U6-dsRNA";以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的XRCC1蛋白表达情况.结果 在转染重组子的细胞中,XRCC1蛋白的表达明显下调,仅相当于正常细胞的38.2%.结论 人支气管上皮细胞人X线修复交叉互补基因1的靶向抑制成功.
关键词： 重组载体 RNA干扰 人X线修复交叉互补基因1 -
N-Ras基因表达沉默与二羟环氧苯并芘转化的人支气管上皮细胞生长的关系
目的 构建N-Rus基因小发卡结构RNA(shRNA)干扰真核表达质粒载体,并初步观察其对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)生长的影响.方法 根据GenBank提供的N-Ras cDNA序列,设计并合成shRNA寡核苷酸片段,与含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建4个真核表达载体,并经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定.转染16HBE-T细胞48 h后,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测重组质粒对N-Bus基因表达的影响;用噻唑蓝法(MTT)观察重组质粒对细胞生长的抑制作用.结果 构建了4个N-Ras shRNA真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致.构建的4个表达载体pGPU6/GFP/Neo-NBas-566、pGPU6/GFP/Neo-NRas-305、pGPU6/GFP/Neo-NRas-613和pGPU6/GFP/Neo-NRus-791分别转染16HBE-T细胞48 h后,RT-PCR显示N-Ras基因mRNA表达水平依次下调95%、70%、92%和60%;Western blot显示蛋白表达依次降低92%、45%、58%和34%.MTT发现16HBE-T细胞的生长受到明显抑制,且与N-Ras基因表达水平正相关.结论 成功构建了N-Ras基因特异性shRNA真核细胞表达载体,有效沉默了N-Rus在16HBE-T细胞中的表达,抑制了恶性转化细胞的生长.
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原癌基因c-mycRNA干扰对A549细胞周期的影响
目的观察针对原癌基因c-myc的RNA干扰对A549细胞周期的影响.
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人DNA聚合酶β基因靶向RNA干扰重组子克隆及序列分析
目的克隆用于人DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,Polβ)基因靶向RNA干扰的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)寡核苷酸绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究人Polβ基因在环境化学污染物所致的DNA损伤修复中的作用机制作准备.方法依据Genbank中人polβ基因的cDNA序列,运用dsRNA oligonucleotide designer设计出用于RNA干扰用的dsRNA寡核苷酸序列,并以化学方法合成之.通过重组DNA技术将合成好的dsRNA克隆到含人pU6启动子的pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体上,以此重组子转化感受态E.coli DH5α,经氨卞青霉素筛选后进行扩增,并抽提质粒.运用EcoR Ⅰ和BglⅡ消化并回收"pU6-dsRNA"目的片段,再将"pU6-dsRNA"亚克隆到pEGFP-C1上,获"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"重组子,并进行酶切鉴定和序列分析.结果经酶切鉴定发现,"pEGFP-C1-pU6-dsRNA"载体重组子处于预期条带位置,序列分析显示与所设计的目的片段序列完全相符.结论作者克隆了用于人Polβ基因靶向RNA干扰的dsRNA绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-pU6-dsRNA",为进一步研究Polβ基因功能作好了准备.
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载体介导的人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向RNA干扰
目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞中的表达,为研究DNA聚合酶β在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备.方法利用分子克隆技术构建含pU6启动子的人DNA聚合酶β基因RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子"pEGFP-C1-U6-dsRNA";以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的DNA聚合酶β表达情况.结果在转染重组子的细胞中,DNA聚合酶β的表达明显下调,仅相当于正常细胞的17.3%.结论人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向抑制成功.
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RNA干扰技术建立人PARP-1缺陷细胞株
目的建立并鉴定聚ADP-核糖聚合酶1(hPARP-1)缺陷细胞株,用于研究hPARP1 基因的作用机制及其缺陷与DNA损伤发生的关系.方法将用已经构建的pEGFP-C1-shRNA(包含两个PARP1基因及一个阴性对照)转染支气管上皮细胞(16-HBE),使之在16-HBE中表达,转染后命名为16-HBEP1、16-HBEP2及16-HBEN.用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP1 基因的表达水平.结果 pEGFP-C1-shRNA在真核细胞成功表达; 16-HBEP1和16-HBEP2的蛋白表达水平分别下降了84.3%及63.7%.结论 hPARP1缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hPARP1基因功能研究提供了一种有效手段.
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应用定量竞争RT-PCR筛选芳香烃受体基因RNA干扰片段
目的筛选对人气管上皮细胞株16HBE芳香烃受体基因mRNA表达有效抑制的特异RNAi片段.方法自行制备内参照为竞争模板,应用定量竞争RT-PCR方法,分别检测转染有4个不同芳香烃受体基因RNA干扰位点的16HBE细胞芳香烃受体mRNA的表达,评价不同片段的RNA干扰效果.结果转染4种芳香烃受体基因RNA干扰片段的16HBE细胞的每40ng总RNA芳香烃受体基因mRNA平均表达量分别为5.65fg、14.78fg、3.14fg和0.68fg,mRNA表达平均抑制率分别为61.6%、-0.5%、78.6%和95.4%.结论应用定量竞争RT-PCR准确地定量基因的mRNA表达水平,筛查出芳香烃受体基因RNA干扰有效序列,为进一步研究芳香烃受体基因的功能创造了条件.
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短发夹RNA对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响
目的 观察靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)生长增殖的影响.方法 根据RNA干扰原理,利用构建的表达shRNA的靶向hTERT mRNA的真核表达质粒(shRNA1),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2),转染试剂和正常培养液处理细胞.24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况;24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖活性;48h后行HE染色、RT-PCR及端粒酶活性检测.结果 (1)共聚焦显微镜下见shRNA1及shRNA2组有大量的细胞表达荧光.(2)相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异.HE染色发现,同等培养条件下,各组细胞生长密度及形态无明显变化.(3)RT-PCR显示各组细胞均无hTERT mRNA的表达;端粒酶活性均为阴性表达.结论 靶向hTERT mRNA的shRNA对正常hMSCs的生长增殖无明显影响,该方法对不表达hTERT的正常体细胞是安全的.
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bax基因siRNA序列的筛选及其对铝致神经胶质瘤细胞凋亡的影响
目的 应用RNA干扰技术降低促凋亡基因bax的表达,以阻抑铝诱导的神经胶质瘤细胞凋亡.方法 设计了3对阻抑bax基因表达的siRNA序列,对神经胶质瘤细胞进行了转染,根据不同siRNA序列在不同转染剂量、不同转染时间的细胞活力,找到bax siRNA转染的佳转染剂量和适转染时间.依据RNA干扰前后bax基因的表达变化筛检出有效的siRNA序列.用荧光染色法、荧光定量PCR法和免疫组织化学染色法分别检测其转染效率、对基因表达的干扰效率及对蛋白表达的阻抑效应.结果 有效的针对bax基因的siRNA序列为siRNA1,该序列的转染效率90%,时bax基因表达的干扰效率为62.3%.佳转染后检测点为转染后72h,适转染剂量为20nmo/L.结论 阻抑bax基因表达的siRNA序列能有效干扰bax基因和蛋白的表达,降低凋亡率.
