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N-Ras基因表达沉默与二羟环氧苯并芘转化的人支气管上皮细胞生长的关系
目的 构建N-Rus基因小发卡结构RNA(shRNA)干扰真核表达质粒载体,并初步观察其对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化的人支气管上皮细胞(16HBE-T)生长的影响.方法 根据GenBank提供的N-Ras cDNA序列,设计并合成shRNA寡核苷酸片段,与含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建4个真核表达载体,并经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定.转染16HBE-T细胞48 h后,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测重组质粒对N-Bus基因表达的影响;用噻唑蓝法(MTT)观察重组质粒对细胞生长的抑制作用.结果 构建了4个N-Ras shRNA真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致.构建的4个表达载体pGPU6/GFP/Neo-NBas-566、pGPU6/GFP/Neo-NRas-305、pGPU6/GFP/Neo-NRas-613和pGPU6/GFP/Neo-NRus-791分别转染16HBE-T细胞48 h后,RT-PCR显示N-Ras基因mRNA表达水平依次下调95%、70%、92%和60%;Western blot显示蛋白表达依次降低92%、45%、58%和34%.MTT发现16HBE-T细胞的生长受到明显抑制,且与N-Ras基因表达水平正相关.结论 成功构建了N-Ras基因特异性shRNA真核细胞表达载体,有效沉默了N-Rus在16HBE-T细胞中的表达,抑制了恶性转化细胞的生长.
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基因芯片筛选二羟环氧并芘转化支气管上皮细胞相关基因的研究
目的应用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘(BPDE)转化细胞的相关基因,探讨基因芯片技术高通量筛查在细胞、分子毒理学研究中的应用价值.
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Ras基因家族在二羟环氧苯并(a)芘恶性转化细胞中的表达研究
目的 检测环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞Ras基因家族表达的影响.方法 以正常人支气管上皮细胞为对照组,经BPDE恶性转化人支气管上皮细胞为实验组,分别利用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法,检测Ras基因家族在mRNA和蛋白水平表达变化.结果 RT-PCR实验表明,BPDE恶性转化细胞H-Ras、K-Ras和N-Ras mRNA表达水平分刺是正常细胞的2.237、1.254和3.616;Western blot实验显示,H-Ras、K-Ras和N-Ras蛋白表达量分别是正常细胞的1.273倍、1.547和1.600倍;免疫细胞化学实验表明,恶性转化细胞H、K和N-Ras蛋白表达明显强于正常细胞.结论 BPDE诱发人支气管上皮细胞恶性转化存在H-Ras、K-Ras和N-Ras基因过表达.
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二羟环氧苯并芘诱导致癌相关差异表达cDNA序列的克隆
目的克隆苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene, BPDE)诱导的人上皮细胞致癌相关差异表达cDNA序列.方法以BPDE诱导恶性转化的人支气管上皮细胞株16HBE为模型,采用cDNA代表性差异分析方法,比较转化细胞及正常对照细胞间基因表达的差异,分离恶变细胞中差异表达的cDNA片段.分离的片断分别与pGEM-T载体连接并转化入JM109细菌中,对质粒DNA进行测序.以BLASTN程序进行GenBank的同源性检索.结果克隆的13条cDNA序列中,有5条为新基因序列,已在dbest数据库中注册,其登录号分别为BG354691、BG354692、BG354693、BG354694和BG354695;8条cDNA有同源序列,分别与核糖体蛋白S23、MLN137、ACTN4、转移生长因子及G蛋白基因等有同源性.结论克隆的13条cDNA序列可能与BPDE诱发细胞恶性转化密切相关.
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二羟环氧苯并芘对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响
目的 探讨环境致癌物苯并(a)芘代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE)对人支气管上皮细胞N-Ras基因表达的影响.方法利用RT-PCR和Western blot方法,分别检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平的变化.利用免疫细胞化学方法检测N-Ras基因在经BPDE恶性转化细胞中定位和蛋白表达量的变化.结果 RT-PCR和Western blot实验表明,BPDE恶性转化细胞N-Ras基因的mRNA和蛋白水平分别是正常细胞的3.616和1.600倍.免疫细胞化学实验显示,在BPDE恶性转化细胞和正常细胞中,N-Ras基因在细胞膜和细胞浆中均有表达,且两者相比,前者中的N-Ras蛋白表达明显强于后者.结论 N-Ras基因可能在BPDE的致癌机制中起着重要作用.
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二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化佳实验方案
目的采用客观又简单的软琼脂细胞集落形成率的指标来探索二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞转化的理想实验方案，构建恶性转化的细胞模型。方法根据细胞存活率试验及克隆形成率试验确定诱导的剂量，以不同剂量二羟环氧苯并芘1次或多次处理细胞，观察培养的不同阶段转化灶出现情况，用软琼脂培养鉴定其锚着依存性生长的恶性特征，比较各组转化细胞的集落形成率。结果以0.1、0.5、1.0、2.0 μmol/L的剂量，对细胞多次间断染毒，传代15次，是二羟环氧苯并芘诱导16HBE细胞恶性转化的理想方案，其集落形成率分别为2.0‰、5.5‰、7.0‰、10.5‰，剂量-反应关系呈现良好的直线相关，r＝0.9741，P＜0.05。结论二羟环氧苯并芘能诱导人支气管上皮细胞16HBE转化，构建理想的恶性转化的细胞模型。
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N-Ras基因靶向的shRNA抑制二羟环氧苯并芘诱导的恶变细胞增殖
目的 用小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默N-Ras基因表达,探讨N-Ras基因表达对二羟环氧苯并芘(BPDE)转化人支气管上皮细胞(16HBE-T)恶性性状的影响.方法 将已建立的针对N-Ras基因的shRNA干扰表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-NRas-566转染16HBE-T细胞,经G418筛选,建立稳定沉默N-Ras基因转化细胞系.采用Western blot筛选佳N-Ras基因沉默细胞系,用流式检测N-Ras沉默细胞周期变化,用软琼脂实验和裸鼠成瘤实验进行细胞表型分析.结果 成功培养出稳定沉默N-Ras基因的16HBE-T细胞系,Western blot显示N-Ras蛋白抑制率高达86%.流式分析发现稳定沉默N-Ras基因表达诱导转化细胞G0/G1期捕获,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现稳定沉默N-Ras基因降低了体外恶性转化细胞的集落形成率、抑制了体内肿瘤细胞生长.结论 N-Ras基因沉默可以降低转化细胞的细胞周期进程和细胞恶性性状表型,提示N-Ras基因在二羟环氧苯并芘诱导细胞恶变过程中具有重要作用.
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二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱
目的 检测二羟环氧苯并芘(BPDE)恶性转化细胞的microRNA(miRNA)表达谱,寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA.方法 以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2.0 μmol/L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE,获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组,同时,以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组.通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA,并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证.结果 获得2组细胞327个miRNA表达谱,发现差异表达miRNA 55个,其中46个表达上调,9个表达下调,并得到反转录荧光定量PCR的验证.结论 获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA,为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础.
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二羟环氧苯并芘致肺癌相关基因筛选
目的 筛选与二羟环氧苯并芘,(BPDE)引发肺癌相关基因的DNA片段,为进一步探讨BPDE致癌机制提供研究依据.方法 应用扩增片段长度多态性(AFLP)结合免疫磁珠分离等技术对与BPDE相互作用的DNA片段进行富集、扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示差异片段,并对其回收、克隆、测序及同源相似性比对分析.结果 成功回收了差异片段,经测序得到其碱基序列,基因同源相似性比对分析发现,有8条序列与已知基因同源,另有1条序列未找到同源序列,将该序列向GenBank提交注册,GenBalak已接受并给予登录号为:EF176681.结论 AFLP结合免疫磁珠分离等技术可以用于化学致癌BPDE肿瘤易感基因的筛选,所得9条基因片段可能与BPDE引发肺癌有关.
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基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因
目的 采用基因芯片技术筛选二羟环氧苯并芘(BPDE)转化的人支气管上皮细胞(16HBE)相关基因,探讨该技术在分子毒理学研究中的应用.方法 将实验组(BPDE-16HBE)和对照组(16HBE)的mRNA逆转录合成cDNA掺入荧光分子为探针,杂交于H40S基因芯片,分析2组基因的差异表达.结果 在4096种人类基因中,BPDE转化的16HBE和正常16HBE间存在差异表达的基因有143条,其中高表达52条,低表达91条.结论 基因芯片技术在筛选BPDE转化的16HBE相关基因改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,在毒物的分子致癌机制研究中意义重大.
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硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究
目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.
