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硫化镍对支气管上皮细胞中磷酸化JNK(P-JNK)表达的影响
目的 通过结品硫化镍在支气管上皮细胞(16HBE)中磷酸化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)表达,探讨镍致癌的分子机制.方法 用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测16HBE细胞中P-JNK的表达.结果 硫化镍能明显激活磷睃化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)的表达,硫化镍浓度越高,磷酸化P-JNK的表达值越高,而且存在剂量-效应关系(r=0.7736),染镍组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 结晶型硫化镍激活16HBE细胞中P-JNK的表达,可能是镍致痛的分子机制之一.
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硫化镍对支气管上皮细胞膜脂质过氧化的影响
目的 探讨硫化镍对支气管上皮细胞脂质过氧化的影响和硫化镍毒性作用机制。方法 采用体外细胞培养方法，观察硫化镍对人支气管上皮细胞膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及超氧化歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)的含量。结果 硫化镍能明显增加MDA及ROS的含量，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；硫化镍能明显降低SOD及GSH-Px含量，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 硫化镍可增加细胞脂质过氧化作用，可能是硫化镍毒性作用机制之一。
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结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究
目的 对结晶型硫化镍(NiS)和反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo(a)pyrene,BPDE)恶性转化及接种裸鼠成瘤的人支气管上皮细胞(16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法、荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹法检测结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因肩动子甲基化状况及其mRNA和蛋白表达,并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2'-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞.结果结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA和蛋白表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失.结论结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制.甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要线索.
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硫化镍对NF-KB基因表达的影响
目的 探讨硫化镍对核转录因子KB(NF-KB)基因表达的影响.方法 人支气管上皮细胞(16HBE)给予低、中、高剂量的硫化镍处理后,使用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测出人支气管上皮细胞(16HBE)中NF-KB的表达,分别在4、8、12和24 h后检测其NF-KB表达的动态变化.结果与生理盐水组比较,硫化镍(中、高剂量组)对NF-KB基因呈高表达,硫化镍(低剂量组)对NF-KB表达的影响与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论硫化镍(中,高剂量)能明显激活NF-KB的表达,可能是硫化镍致癌的分子机制之一.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化相关蛋白硫氧还原蛋白过氧化物酶2的鉴定
目的利用蛋白质组学技术识别结晶型硫化镍(NiS)诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白的差异表达,探讨镍致癌的分子机制.方法应用二维凝胶电泳与相应软件分析结晶型NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组变化,基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS)结合数据库检索鉴定恶性转化相关蛋白.结果获得分辨率和重复性较好的二维凝胶电泳图谱,在相对分子质量14 400～94 000、等电点3～10范围内分离出约700个不同蛋白质点,对差异表达明显的等电点约6,相对分子质量约25 000的蛋白质点进行质谱分析,鉴定出等电点为5.66,相对分子质量为21 890的蛋白/硫氧还原蛋白过氧化物酶2(Peroxiredoxin 2,PDX2),并发现该蛋白在恶性转化细胞中高表达.结论蛋白PDX2可能是参与结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程的重要蛋白分子,与细胞恶性转化有关.
关键词： 硫化镍 细胞转化 支气管 硫氧还原蛋白过氧化物酶2 -
硫化镍对支气管上皮细胞中磷酸化细胞外信号调节蛋白表达的影响
目的 通过结晶硫化镍在支气管上皮细胞(16HBE)中磷酸化细胞外信号调节蛋白(P-ERK1)的表达,探讨镍致癌的分子机制.方法 用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(Western blot)法检测16HBE细胞中P-ERK1的表达.结果 硫化镍不能明显激活P- ERK1的表达,染镍组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 镍不能激活P-ERK1的表达,其机制尚不清楚,硫化镍有可能激活P38和JNK通路,从而直接或间接发挥致癌作用.
关键词： 硫化镍 支气管上皮细胞 磷酸化细胞外信号调节蛋白 -
扶正解毒含药血清对染硫化镍人支气管上皮细胞膜脂质过氧化的影响
目的 探讨扶正解毒含药血清(FJD)拮抗硫化镍(NiS)所致细胞毒作用及其作用机制.方法 采用体外细胞培养方法,观察FJD对染NiS人支气管上皮(16HBE)细胞膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响.结果 NiS能明显增加MDA含量及ROS活力,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);NiS能明显降低SOD及GSH-Px活力,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).在体外染NiS 16HBE细胞培养过程中加入不同浓度的FJD(低、中、高)剂量,中、高剂量组可提高16HBE细胞内SOD及GSH-Px活力(P<0.05),具有剂量一效应关系,FJD能显著抑制MDA生成量及ROS活力,以中、高剂量为甚(P<0.05).结论 NiS可增强细胞脂质过氧化,FJD具有拮抗NiS所致细胞毒性的作用,可能与其抗氧化功能有关.
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致癌物诱导恶变细胞中线粒体高变区序列分析
目的检测苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)及结晶型硫化镍(NiS)诱发永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中线粒体DNA控制区序列变化.探讨线粒体DNA控制区在环境致癌物苯并(a)芘及硫化镍致癌作用中是否存在靶分子序列.方法应用银染PCR-单链构向多态性(SSCP)方法及测序方法分析恶变细胞中线粒体DNA高变区的序列变化.结果经反式-BPDE和NiS诱导恶变的人支气管上皮细胞系线粒体高变区均未发现异常改变.结论线粒体基因控制区可能并非是化学致癌物诱发肺癌的靶序列.
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恶性转化人支气管上皮细胞基因组甲基化观察
目的对反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-BPDE)和结晶型硫化镍(NiS)恶性转化人支气管上皮细胞(Hu-man bronchial epithelia,16HBE)基因组DNA甲基化状况进行研究,寻找DNA甲基化异常的基因片段,探讨反式-BPDE和NiS的表遗传致癌机制.方法采用限制性指纹识别技术(MSRF),对反式-BPDE和NiS分别诱导转化及裸鼠成瘤的4种人支气管上皮细胞株基因组进行分析;对异常甲基化基因阳性片断采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较.结果发现结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞基因组存在高甲基化的DNA片段,其中一基因片段与编码鼻咽癌易感性蛋白ANKRD11基因序列99%同源.另一基因片段与HOXA3基因序列99%同源;未发现反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞基因组DNA异常甲基化基因片段.结论结晶型NiS恶性转化人支气管上皮细胞DNA的高度甲基化可能导致基因表达抑制.可能是结晶型NiS致癌的一种表遗传机制;反式BPDE致癌过程可能与基因组磷酸胞苷酰(CpG)岛甲基化异常关系不明确.
关键词： DNA甲基化 反式二氢二醇环氧苯并芘 硫化镍 基因组 -
硫化镍诱导转化人支气管上皮细胞基因组DNA甲基化的研究
目的对结晶型硫化镍诱导转化及成瘤的人支气管上皮细胞(16HBE)基因组DNA甲基化状况进行研究,以寻找DNA甲基化异常的基因片段,并探讨镍的外遗传致癌机制.方法抽提基因组DNA后,采用限制性内切酶MseI单独酶切或限制性内切酶MseI与BstuI双重酶切后,其酶切产物采用甲基化敏感的限制性指纹识别技术(MSRF)进行分析,显示的异常甲基化基因片断,采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较.结果发现结晶型NiS诱导转化及成瘤的16HBE细胞基因组DNA存在高甲基化的DNA片段.其中一基因片段与位于16q24.3编码鼻咽癌易感性蛋白基因ANKRD11同源(99%),另一基因片段与HOXA3基因序列同源(99%).HOXA3在脊椎动物中编码转录因子,编码调控基因表达,形态发生和变异的DNA结合转录因子.结论结晶型NiS诱导转化及成瘤的16HBE细胞基因组DNA的高度甲基化可能导致基因表达抑制,这可能是结晶型NiS诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种外遗传机制.
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硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究
目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.
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镉和镍恶性转化16HBE上调基因eIF3 p36的克隆与序列
目的 分析镉和镍恶性转化16HBE(人支气管上皮细胞)成瘤细胞株中翻译起始因子eIF3 p36基因序列的变化情况,探讨镉、镍重金属的致癌分子机制.方法 取正常对照16HBE细胞、氯化镉(CdCl2)和结晶型硫化镍(NiS)恶性转化的16HBE细胞,用有限稀释法分别建立单细胞克隆株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得目的基因翻译起始因子eIF3 p36的cDNA,将目的基因产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒.提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序.将三组DNA测序所得到的基因序列进行对比分析.结果 镉、镍转化组各细胞株(各10株)翻译起始因子的eIF3 p36 cDNA测序结果与正常对照细胞(10株)比较未发现基因的突变位点;所有镉、镍转化细胞和正常对照细胞株eIF3 p36 cDNA序列与Genbank数据库进行同源性分析,相似性比值均为100%.结论 实验中镉、镍恶性转化16HBE细胞中翻译起始因子eIF3 p36上调未见基因序列改变,提示在镉、镍致癌中可能涉及到表遗传机制.
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硫化镍转化人支气管上皮细胞基因差异表达芯片的研究
背景与目的近年研究发现硫化镍(NiS)可引起人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,16HBE)发生恶性转化及转化细胞致癌性,其机制可能与NiS引起基因突变、多种转录因子的异常表达有关.为此,本研究利用NiS恶性转化的体外培养细胞模型,用cDNA微阵列技术研究经NiS转化后的16HBE细胞基因的差异表达,从基因组水平探讨NiS所致细胞恶变的相关基因差异改变.方法分别提取16HBE和经NiS单独处理发生转化的NiS-16HBE细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro 3.0软件分析荧光信号,然后对差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS-16HBE细胞样本与16HBE细胞样本比较,呈现差异表达的基因有151个(3.78%),其中81个(53.64%)上调,70个(46.36%)下调.结论 NiS的转化作用与应激反应基因、免疫相关基因、DNA合成和修复基因、代谢相关基因、原癌基因和抑癌基因等多类基因的异常表达有关.
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结晶型硫化镍及反式 -BPDE恶性转化 16HBE细胞 hMSH2基因甲基化的研究
背景与目的: 对结晶型硫化镍 (Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘 (anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞 (Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其 mRNA表达进行研究,探讨镍及反式 -BPDE的表遗传致癌机制.材料与方法: 采用甲基化特异性 PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和 RT-PCR法检测结晶型 NiS及反式 -BPDE恶性转化及成瘤的 16HBE细胞 hMSH2基因启动子甲基化状况及其 mRNA表达,与非转化的 16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子 5-Azac(5-Aza-2′ -deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞. 结果: 发现结晶型 NiS及反式 -BPDE恶性转化及成瘤的 16HBE细胞 hMSH2基因启动子区存在 CpG岛的高甲基化;与非转化 16HBE细胞比较,转化及成瘤的 16HBE细胞 hMSH2基因 mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失.结论: 结晶型 NiS及反式 -BPDE恶性转化及成瘤的 16HBE细胞 hMSH2基因启动子区 CpG岛的高甲基化使其 mRNA表达下降,并可能导致 hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型 NiS及反式 -BPDE诱导 16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制.甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据.
关键词： hMSH2 基因甲基化 硫化镍 反式 -二氢二醇环氧苯并茈
