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068 人支气管上皮细胞体外转化试验的研究进展
细胞转化试验是研究各种理化因素致癌机制的有效方法.与其它细胞转化试验相比,人支气管上皮细胞恶性转化试验克服了种属和组织学差异,可以在体外条件下模拟体内细胞受致癌原作用后向肿瘤细胞演变的过程,在细胞水平观察到典型的恶性转化表型,在分子水平研究致癌因素的作用机制,为癌变分子机制的研究提供了良好的模型,也为外来化学物质的致癌性检测提供了新的有效途径.
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硫化镍对NF-KB基因表达的影响
目的 探讨硫化镍对核转录因子KB(NF-KB)基因表达的影响.方法 人支气管上皮细胞(16HBE)给予低、中、高剂量的硫化镍处理后,使用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测出人支气管上皮细胞(16HBE)中NF-KB的表达,分别在4、8、12和24 h后检测其NF-KB表达的动态变化.结果与生理盐水组比较,硫化镍(中、高剂量组)对NF-KB基因呈高表达,硫化镍(低剂量组)对NF-KB表达的影响与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论硫化镍(中,高剂量)能明显激活NF-KB的表达,可能是硫化镍致癌的分子机制之一.
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反式二氢二醇环氧苯并芘诱发细胞P53基因的变化
目的观察苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo(a)pyrene,BPDE]诱发的恶性转化的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)及其裸鼠成瘤细胞中的p53基因突变情况,探讨BPDE诱导细胞癌变的机制.方法多聚酶链聚合反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、基因测序.结果PCR-SSCP分析结果提示,反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞p53基因的Exon 7和Exon 8有突变.基因测序发现裸鼠成瘤细胞(B3)的p53基因Exon 8的第282位密码子位置出现了一个G→T点突变,其编码的氨基酸由精氨酸(CGG)→亮氨酸(CTG).结论反式BPDE可诱导p53基因发生突变,提示p53基因突变可能是BPDE诱导细胞癌变的重要机制之一.
关键词： 苯并(a)芘[B(a)P] 反式BPDE 人支气管上皮细胞 p53基因 -
烟草中甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发人支气管上皮细胞恶性转化的研究
目的研究吸烟致肺癌过程中人类支气管上皮细胞恶变机制,探索一种较快捷的体外研究吸烟致肺癌的途径.方法采用细胞毒性实验确定亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)水溶液转化剂量为600μg/ml,应用NNK多次染毒法对人支气管上皮细胞系(16HBE)进行转化,对转化组织和细胞分别进行病理学检查和透射电镜与扫描电镜分析.结果16HBE细胞染毒至第23代,细胞呈恶性形态;可以在软琼脂上形成集落(锚着非依赖性实验为阳性);裸鼠成瘤实验为阳性.对裸鼠成瘤组织进行病理组织学检查,证实为低分化鳞状细胞癌,并取裸鼠成瘤组织原代培养细胞作扫描电镜和透射电镜检查,结果显示为瘤组织培养细胞具有恶性型肿瘤细胞的特征.结论NNK致16HBE细胞恶性转化能力较强,为深入研究人类支气管上皮细胞恶变机制提供了理想的生物模型.
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GMA致人支气管上皮细胞恶性转化过程中全基因组甲基化水平的研究
目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮细胞(16HBE细胞)恶性转化过程中不同时点全基因组甲基化水平的改变,探讨GMA诱导16HBE细胞全基因组甲基化水平改变的意义.方法 通过细胞毒性试验,确定8μg/ml浓度GMA诱导16HBE细胞,收集GMA转化前期(第10代)、转化中期(第20代)、转化后期(第30代)细胞和同步溶剂对照(DMSO)细胞,以及去甲基化制剂(5-氮杂-2-脱氧胞苷,5-aza-cdr)处理的各时点转化细胞,应用DNA甲基化定量检测试剂盒,检测不同转化时期细胞全基因组甲基化水平.结果 DNA甲基化定量检测结果显示,不同时点GMA转化组较同代龄DMSO组细胞全基因组甲基化水平降低,转化前期GMA组、DMSO组、5-aza-cdr组细胞甲基化水平较转化中期及转化后期相对应各组的全基因组甲基化水平低.结论 GMA诱导16HBE细胞在转化前期已出现全基因组低甲基化现象,故可将其视为细胞恶性转化前期生物标志.
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二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析
目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.
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甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞染色体损伤的研究
目的 研究甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮(16HBE)细胞染色体损伤的情况,探讨其潜在致癌性.方法 GMA染毒16HBE细胞后,收获不同染毒剂量(4、8、12、16、20μg/ml)、染毒次数(1、2、3次)、转化代数(10、30代)的细胞进行染色体畸变分析.结果 在4～20μg/ml剂量范围内,随染毒剂量的增加,染色体畸变率(3％、6％、7％、11％、14％)升高,并呈剂量-反应关系；随着染毒次数增加,3次染毒的细胞染色体畸变率(6％、7％、10％)显著增高；转化第10代细胞表现为染色体结构畸变,而转化第30代细胞主要表现为染色体数目畸变.结论 GMA能够诱导16HBE细胞染色体畸变,且畸变类型由早期的结构畸变转变为数目畸变.
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探讨Co60γ射线对放射性肺纤维化 支气管上皮细胞的影响
目的:探讨Co60γ射线对放射性肺纤维化中支气管上皮细胞的影响.方法:用Co60γ射线6 Gy的照射剂量照射人支气管上皮细胞,未照射的人支气管上皮细胞作为对照组,比较两组细胞的周期变化、凋亡比例.结果:照射组细胞相比于对照组细胞周期生长阻滞,并且流式细胞仪结果显示,细胞周期较多阻滞在G2期,差异具有统计学意义(P<0.05).流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明,照射组细胞相比于未照射组细胞明显发生凋亡,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:Co60γ射线能明显影响人支气管上皮细胞正常的生长增殖以及促进细胞的凋亡.
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miR-542-3p在反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘诱导致癌中的作用
目的 探讨反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-BPDE)诱导恶变的人支气管上皮细胞(16HBE-T)中miR-542-3p在细胞恶性转化中的作用.方法 运用实时荧光定量PCR法验证miR-542-3p成熟体在16HBE-T和非转化对照细胞(16HBE-N)中的表达水平.瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平,检测miR-542-3p表达水平改变对16HBE-T细胞的增殖能力、细胞周期、细胞凋亡、软琼脂克隆形成率及细胞迁移能力的影响.结果 转染前16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是16HBE-N的(39.08±6.95)%(t=15.18,P＜0.05).瞬时转染化学合成的miR-542-3p模拟物上调16HBE-T的miR-542-3p成熟体表达水平后,16HBE-T中miR-542-3p成熟体表达水平是转染前的(5.23±0.55)倍(t=17.37,P＜0.05).miR-542-3p模拟物组(mimic组)与16HBE-T组(100%)相比,增殖率下降到(62.06±5.61)%(t=-17.28,P＜0.05),G0/G1期比例上升到(74.76±4.86)%(t=4.53,P＜0.05),克隆形成率降低为(5.87±0.67)%(t=-6.66,P＜0.05).mimic组生长细胞覆盖区面积比(0.31±0.08)明显降低(t=-6.78,P＜0.05),凋亡无改变.结论 miR-542-3p表达水平升高会降低anti-BPDE恶性转化细胞的增殖能力和恶性程度,推断miR-542-3p是类抑癌基因,在anti-BPDE诱导致癌过程中低表达的miR-542-3p可能是促成恶性转化的重要因素.
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聚-ADP-核糖基化在六价铬致细胞损害中的作用机制探讨
目的 探讨聚-ADP-核糖基化在Cr(Ⅵ)致细胞损害中的作用.方法 选用前期建立的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)作为研究对象,选用不同剂量的Cr(Ⅵ)分别染毒,并处理正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞24 h,同时设立溶剂对照组,比较两种细胞对Cr(Ⅵ)毒作用的差异;在此基础上,选取5.0 μmol/L的Cr(Ⅵ)作为染毒剂量,染毒处理两种细胞后,提取细胞总蛋白进行双向荧光差异凝胶电泳(2 D-DIGE)分析,计算比较两种细胞染毒前、后的总蛋白表达差异,对差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定,并进一步使用Western blot验证.结果 Cr(Ⅵ)作用后,PARG缺陷细胞的存活较正常16HBE细胞多,当作用剂量达到5.0 μmoL/L时,16HBE细胞和PARG缺陷细胞的存活率分别为(59.67±6.43)％和(82.00±6.25)％,两者之间的差异有统计学意义(t=-4.32,P＜0.05);2D-DIGE分析比较正常16HBE细胞与PARG缺陷细胞Cr(Ⅵ)染毒前、后蛋白差异,共筛选且成功鉴定出18个蛋白,这些蛋白的功能涉及维持细胞形态、参与能量代谢、DNA损伤修复以及基因表达调控.Western blot成功验证出差异表达蛋白cofilin-1,其在染毒后的16HBE细胞中表达上调,相对表达量为1.41 ±0.04,对照组表达量为1.00±0.01,差异有统计学意义(t=-18.00,P＜0.05).在PARG缺陷细胞表达差异无统计学意义(t=-8.61,P＞0.05).结论 鉴定出的差异蛋白大多与肿瘤发生密切相关,推测聚-ADP-核糖基化反应可通过抑制Cr(Ⅵ)诱导的肿瘤发生从而对抗Cr(Ⅵ)的细胞毒性,这为阐明聚-ADP-核糖基化在Cr(Ⅵ)致细胞损害中的作用机制提供了重要的参考依据.
关键词： 铬 细胞 聚-ADP-核糖基化 双向荧光差异凝胶电泳 人支气管上皮细胞 -
聚-ADP-核糖基化在六价铬诱导人支气管上皮细胞基因组DNA甲基化水平改变中的作用
目的 研究聚-ADP-核糖基化与DNA甲基化在六价铬[Cr(Ⅵ)]致癌过程中的作用,并对两者之间的联系进行探讨.方法 选用前期建立的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)作为研究对象,使用Cr(Ⅵ)分别对正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞进行处理,通过甲基化免疫荧光技术分析两种不同细胞基因组DNA整体甲基化水平变化,同时检测整体甲基转移酶活性的变化,并进一步利用RT-PCR和western-blotting分别从mRNA和蛋白水平上分析DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2)的表达变化.结果 正常16HBE细胞Cr(Ⅵ)处理24h后,基因组DNA甲基化水平降低,且具有剂量-效应关系,而PARG缺陷细胞此种表现不明显；当Cr(Ⅵ)的作用剂量为5.0 μmol/L时,16HBE细胞和PARG缺陷细胞内总体DNA甲基转移酶活性分别为49.33±2.65、80.05±2.05,较对照组(分别为99.27±1.10、99.30±0.60)下降了50％和20％.正常16HBE细胞Cr(Ⅵ)处理24 h后,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2的mRNA和蛋白水平表达均呈下降趋势.PARG缺陷细胞中DNMT1和DNMT3a的表达出现下调,0、0.3、1.2、5.0 μmol/LCr(Ⅵ)处理组胞内DNMT1 mRNA的相对表达量分别为0.99 ±0.04、0.79±0.05、0.65±0.08、0.51±0.10(F =544.13,P＜0.01),蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、0.69±0.15、0.65 ±0.10、0.55±0.13(F=214.12,P＜0.01)；DNMT3a mRNA的相对表达量分别为1.00±0.04、0.93±0.11、0.79±0.07、0.59±0.05(F =498.16,P＜0.01),蛋白相对表达量分别为1.00 ±0.14、0.97 ±0.11、0.79±0.17、0.57 ±0.15(F =390.11,P＜0.01)；但DNMT3b和MBD2表达改变不明显.结论 聚-ADP-核糖基化可通过调节DNMT3b和MBD2的活性,对抗Cr(Ⅵ)诱导的广泛基因组低甲基化,维持细胞基因组整体甲基化水平的稳定.
关键词： 铬 DNA甲基化 人支气管上皮细胞 聚-ADP-核糖基化 -
人支气管上皮细胞体外传代培养方法
目的：探讨一种对人支气管上皮细胞株（16HBE）进行体外培养及传代的新方法。方法用89％1640培养液＋10％FBS （胎牛血清）＋1％双抗对16HBE进行培养；待细胞贴壁后用0.25％胰酶进行消化传代。结果16HBE生长良好，贴壁率达80％以上，传代后呈铺路石样镶嵌。讨论用89％1640培养液＋10％FBS＋1％双抗及0.25％胰酶可成功对16HBE进行传代培养。
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五倍子含药血清对呼吸合胞病毒感染人支气管上皮细胞损伤及NF-κB核转位和表达的影响
目的:探讨五倍子含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支气管上皮细胞损伤及细胞核因子-κB(NF-κB)核转位和表达的影响.方法:实验分为正常组、病毒处理组、含药血清组,给予相应处理后,进行指标检测.结果:病毒处理组在细胞内病毒核酸的相对表达量和对细胞增殖的抑制率随着浓度的增加而增加,且出现明显的晚期凋亡现象,含药血清能明显抑制上述现象;免疫荧光和Western blot结果显示,RSV感染后NF-κB发生了核转位,而含药血清能明显抑制NF-κB的核转位.结论:五倍子含药血清能抑制RSV病毒的复制,同时通过抑制NF-κB发生核转位,抑制RSV诱导的人支气管上皮细胞的凋亡,进而降低细胞增殖的抑制率.
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白细胞介素-4诱导人支气管上皮细胞ORMDL3基因表达的时效性
目的:观察白细胞介素-4 (IL-4)诱导人支气管上皮细胞(16HBE)不同时间血清类黏蛋白1样蛋白3(ORMDL3)的表达,探讨在细胞模型中IL-4对ORMDL3的转录和合成的影响.方法:用100ng/mL的IL-4诱导支气管上皮细胞后,分别在不同时间段(0、12、18、24、36、48h)用RT-PCR法检测ORMDL3 mRNA的表达,Western Blot法检测ORMDL3蛋白的表达.结果:正常支气管上皮细胞有微量的ORMDL3表达,IL-4诱导细胞后,ORMDL3mRNA和蛋白的表达均增加,在一定范围内呈时间依懒性,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其他各组与24h组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:IL-4能诱导ORMDL3高表达,并且在一定范围内呈时间依赖性.
关键词： 白细胞介素-4 人支气管上皮细胞 血清类黏蛋白1样蛋白3 时效 -
大承气汤含药血清对内毒素刺激的人支气管上皮细胞表达CAV-1、eNOS及NF-κB的影响
目的 观察大承气汤含药血清对内毒素( lipopolysaccharide,LPS)刺激的人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)表达小凹蛋白-1(caveolin-1、CAV-1),内皮型一氧化氮合酶( endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及核转录因子κB (nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)的影响.方法 制备大承气汤及大承气汤含药血清.将体外培养的HBECs分为7组进行处理(正常血清组,单纯LPS干预组,低剂量大承气汤含药血清组,中剂量大承气汤含药血清组,高剂量大承气汤含药血清组,西药对照组,空白血清对照组),采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、Real-time PCR、免疫细胞化学及Western blot法检测不同剂量的大承气汤含药血清对内毒素刺激HBECs表达CAV-1、eNOS及NF-κB mRNA水平及蛋白的影响.结果 正常血清组HBECs有基础量的CAV-1、eNOS及NF-κB mRNA及蛋白的表达,经LPS刺激后,单纯干预组CAV-1、eNOS及NF-κB mRNA及蛋白表达较正常血清组显著增加(P＜0.01),而不同剂量大承气汤含药血清均可抑制CAV-1、eNOS及NF-κB mRNA及蛋白表达.结论 大承气汤含药血清能抑制LPS刺激的HBECs中CAV-1、eNOS及NF-κB的表达.
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脂多糖诱导SPLUNC1基因的表达
目的 了解脂多糖(LPS)对人支气管上皮细胞(HBECs)增殖的影响,通过观察不同浓度脂多糖(LPS)不同时间诱导HBECs的短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)基因表达情况,探讨SPLUNC1在呼吸道感染中的作用.方法 采用0.01、0.1、1.0、10 mg/L LPS诱导HBECs,通过噻唑蓝(MMT)法检测LPS对HBECs增殖的影响,诱导HBECs 2、4、8、16、24 h后通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测SPLUNC1基因表达情况,结果以SPLUNC1/GAPDH基因拷贝数比值表示.结果 0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS均可抑制HBECs的生长〔吸光度(A值):0.48±0.03、0.37±0.01、0.30±0.03、0.27±0.02,相对生长指数:94.12％、72.55％、58.82％、52.94％〕,并能诱导SPLUNC1基因表达上调;在同一浓度组,LPS刺激细胞2 h后SPLUNC1基因表达开始上调,随着时间延长逐渐升高,呈时间依赖性〔0.01 mg/L组2、4、8、16、24 h分别为0.19±0.03、0.24±0.04、0.26±0.03、0.44±0.05、0.51±0.07;0.1 mg/L组分别为0.43±0.02、0.52±0.05、0.60±0.06、0.63±0.08、0.68±0.05;1.0 mg/L组分别为0.44±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.58±0.05、0.70±0.06;10 mg/L组分别为0.34±0.03、0.38±0.04、0.68±0.05、0.96±0.08、0.98±0.07〕,不同时间点组间比较差异有统计学意义(均P<0.01).结论 LPS可抑制HBECs的生长,能诱导HBEC细胞SPLUNC1基因表达上调,并在一定浓度范围内表达呈时间依赖性,推测SPLUNC1可能参与细菌感染初的防御.
关键词： 脂多糖 人支气管上皮细胞 短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1 -
二甲亚砜对染毒支气管上皮细胞的保护作用分析
目的 在观察铀矿粉对体外培养的支气管上皮细胞的毒性作用同时,加入二甲亚砜,以了解其在支气管上皮细胞受铀矿粉染毒时的可能保护机制.方法 将不同浓度的铀矿粉与体外培养的支气管上皮细胞进行长时间接触,分为对照组、染毒组和二甲亚砜(DMSO)保护组,通过血清抗性实验等,观察各组间细胞受损的情况.结果 随着铀矿粉浓度的增高,支气管上皮细胞受损明显加重,加入二甲亚砜的支气管上皮细胞受损情况好于未加入者.DMSO对铀矿尘作用于BEAS-2B细胞后,可引起细胞DNA断裂,造成细胞拖尾率、彗星尾部DNA含量、尾长、尾部面积、尾距增加具有较好的抑制作用.结论 铀矿粉对支气管上皮细胞有明显的恶性转化作用,可能是铀矿粉对肺损伤的主要机制,二甲亚砜具有一定的保护作用.
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pEGFP-C3/SUMF2重组真核表达载体的构建及在人支气管上皮细胞中的表达
目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合的人硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)真核表达载体.方法 用RT-PCR技术从人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEC)获得SUMF2的cDNA模板,PCR方法扩增人SUMF2基因.用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切扩增人SUMF2基因及质粒pEGFP-C3;将2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10;挑取菌落培养,提取质粒,酶切鉴定,测序;将测序正确的重组载体用脂质体法转染HBEC,荧光倒置显微镜观察.提取转染细胞的总蛋白进行Western blot检测.结果 扩增出1条约857bp的片段,与预期的SUMF2大小相符.酶切结果显示重组质粒pEGFP-C3/SUMF2被切成2条片段,其中1条为pEGFP-C3载体,另1条为目的 片段.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_ 015411.2)中的序列高度同源.荧光倒置显微镜观察显示,人SUMF2基因主要在内质网表达.Western blot结果显示在相对分子质量为37×103处有一蛋白条带,与预期大小相符.结论 成功构建重组表达载体pEGFP-C3/SUMF2,为进一步研究SUMF2对IL-13的作用奠定了实验基础.
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氯化镉恶性转化16HBE细胞中ERCC1基因表达和序列的变化
目的 探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中,ERCC1基因mRNA和蛋白动态变化的规律及其序列变化情况.方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学SP法,检测16HBE细胞及其CdCl2恶性转化细胞不同阶段(第5、15、35代细胞及成瘤细胞)ERCC1基因mRNA和蛋白的表达情况.用直接测序法,分析ERCC1基因第3、4外显子的序列情况.结果 随着转化代数的增加,ERCC1基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下调,mRNA表达从16HBE的0.7028±0.0170下降到第35代细胞的0.3480±0.0453,蛋白表达强度从16HBE的8.40±1.34下降到第35代细胞的0.20±0.44,差异均有统计学意义(P＜0.01).ERCC1基因第4外显子在第1位点出现腺嘌呤(A)缺失,为移码突变.结论 镉致癌的分子机制可能与ERCC1基因水平的下调和突变有关.
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永生化人支气管上皮细胞中TGF-β1对MAPK家族ERK通路的活化效应
目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)在永生化人支气管上皮细胞BEP2D信号转导中MAPK家族ERK通路的激活情况及其引起的细胞增殖、凋亡和形态学的改变.方法 用Western blot方法检测TGF-β1对ERK的活化特点;用荧光染料染色分析和流式细胞术检测TGF-β1引起ERK活化时细胞的凋亡变化;用细胞克隆形成率分析TGF-β1引起ERK活化时细胞的增殖情况;观察TGF-β1引起ERK活化时细胞的形态改变.结果 TGF-β1可在短时间内激活ERK1/2,1h达峰值,然后逐渐减弱;TGF-β1诱导BEP2D细胞凋亡,抑制其增殖,使其体积和间距增大;用U0126抑制ERK通路,能促进TGF-β1对细胞在凋亡、增殖方面的作用,但抑制其对细胞形态的影响.结论 TGF-β1诱导的ERK1/2的磷酸化在调节BEP2D细胞的增殖和凋亡间的平衡方面起着重要作用.
