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人类乳头瘤病毒及其相关疾病
乳头瘤是由HPV引起的全身皮肤粘膜增生性疾病,尖锐湿疣又是重要的性传播疾病.HPV的基因组为双链封闭的环状DNA,含有8kb.HPV引起的良性乳头瘤可向恶性转化,这种转化过程往往需要较长时日.
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068 人支气管上皮细胞体外转化试验的研究进展
细胞转化试验是研究各种理化因素致癌机制的有效方法.与其它细胞转化试验相比,人支气管上皮细胞恶性转化试验克服了种属和组织学差异,可以在体外条件下模拟体内细胞受致癌原作用后向肿瘤细胞演变的过程,在细胞水平观察到典型的恶性转化表型,在分子水平研究致癌因素的作用机制,为癌变分子机制的研究提供了良好的模型,也为外来化学物质的致癌性检测提供了新的有效途径.
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DNMTs在长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用
目的 检测经长期氡暴露而发生恶性转化的人永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)中甲基化转移酶(DNMT)基因的动态变化,从表观遗传学层面探索氡致肺癌的作用机制.方法 应用流式细胞仪分析法,软琼脂集落形成及裸鼠成瘤实验鉴定长期氡暴露过程中BEAS-2B细胞的恶性转化程度,以QPCR方法检测DNMT1、DNlMT3A的mRNA表达量.结果 与对照组细胞相比,染氡30代传代至40代的细胞软琼脂克隆形成率已升高至27.27％±1.10％(P＜0.05),转化细胞在裸鼠体内成瘤率达到30％(P＜0.05),呈低分化癌;QPCR结果显示各染氡组传至40代细胞DNMT1 mRNA表达量均低于对照组,DNMT3A mRNA表达量均高于对照组.结论 建立并确认了体外染氡诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型,且细胞恶性程度随染氡代数和传代代数的增加呈现剂量-效应关系,细胞出现移植成瘤.本试验条件下,DNMTs表达的改变导致细胞增殖失控,打破内环境平衡,这可能是在表观遗传学中,长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化的机制之一.
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塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化(一)
目的研究塞替派对人类支气管上皮细胞的致癌转化效应.方法利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为靶细胞模型,以塞替派诱导BEAS.-2B细胞的恶性转化,并伴随研究了塞替派转化细胞(EBAS-TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征.结果经传代和软琼脂培养基筛选,BEAS-TE具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性.结论塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应.
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香烟烟雾处理对BEAS-2B细胞FHIT基因甲基化及其mRNA表达的影响
目的 观察永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)经香烟烟雾长期处理后FHIT基因甲基化状况及其mRNA表达改变,探索吸烟致肺癌的机制.方法 BEAS4B以20％烟雾浓度,每次10min作为染烟条件,细胞连续染烟2次作为染烟1代.细胞染烟30代且传代40代后,应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡和软琼脂克隆法检测克隆形成率判断其恶性转化程度,用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测FHIT基因甲基化状况,并通过Q-PCR检测FHIT的mRNA表达量.结果 与对照组比较,各染烟组细胞出现了一定的S期阻滞,染烟后传代至40代细胞凋亡率较对照组下降明显(P＜0.05).染烟20代传代至40代细胞(Sm20-40)与染烟30代传代至40代细胞(Sm3040) FHIT基因启动子区呈高甲基化状态,且Q-PCR结果显示Sm20-40和Sm30-40组细胞FHIT基因mRNA均低于对照组(P＜0.05).结论 香烟烟雾可导致BEAS4B细胞FHIT基因启动子区呈高甲基化状态,引起FHIT基因mRNA表达降低,可能是吸烟致肺癌的机制之一.
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烟草中甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发人支气管上皮细胞恶性转化的研究
目的研究吸烟致肺癌过程中人类支气管上皮细胞恶变机制,探索一种较快捷的体外研究吸烟致肺癌的途径.方法采用细胞毒性实验确定亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)水溶液转化剂量为600μg/ml,应用NNK多次染毒法对人支气管上皮细胞系(16HBE)进行转化,对转化组织和细胞分别进行病理学检查和透射电镜与扫描电镜分析.结果16HBE细胞染毒至第23代,细胞呈恶性形态;可以在软琼脂上形成集落(锚着非依赖性实验为阳性);裸鼠成瘤实验为阳性.对裸鼠成瘤组织进行病理组织学检查,证实为低分化鳞状细胞癌,并取裸鼠成瘤组织原代培养细胞作扫描电镜和透射电镜检查,结果显示为瘤组织培养细胞具有恶性型肿瘤细胞的特征.结论NNK致16HBE细胞恶性转化能力较强,为深入研究人类支气管上皮细胞恶变机制提供了理想的生物模型.
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香烟烟雾诱发BEAS-2B细胞体外恶性转化的研究
目的 通过香烟烟雾体外染毒诱发细胞恶性转化,建立吸烟致肺癌的细胞模型.方法 确定合适染烟浓度及时间后,将永生化人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞分为对照组(C)和20%烟雾浓度组(S).以每孔1×10<'5>细胞接种于Transwell培养皿,贴壁后置于气体染毒装置中,香烟烟雾持续泵入直接对细胞染毒.检测染毒后5、10、15、20代细胞恶性转化情况,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡变化.结果 BEAS-2B细胞在20%烟雾浓度下染毒5代后,出现生长动力学和形态学改变,生长失去接触抑制、获得对血清诱导分化的抗性和锚着独立性生长能力.G1期细胞百分比明显降低,S期细胞百分比明显升高,G2期细胞百分比先升高后降低,各代细胞凋亡率均明显降低.结论 香烟烟雾染毒能够诱发BEAS-2B细胞体外转化,且随染毒代数的增加呈现剂量效应关系,可作为体外研究吸烟致肺癌的细胞模型.
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GMA致人支气管上皮细胞恶性转化过程中全基因组甲基化水平的研究
目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮细胞(16HBE细胞)恶性转化过程中不同时点全基因组甲基化水平的改变,探讨GMA诱导16HBE细胞全基因组甲基化水平改变的意义.方法 通过细胞毒性试验,确定8μg/ml浓度GMA诱导16HBE细胞,收集GMA转化前期(第10代)、转化中期(第20代)、转化后期(第30代)细胞和同步溶剂对照(DMSO)细胞,以及去甲基化制剂(5-氮杂-2-脱氧胞苷,5-aza-cdr)处理的各时点转化细胞,应用DNA甲基化定量检测试剂盒,检测不同转化时期细胞全基因组甲基化水平.结果 DNA甲基化定量检测结果显示,不同时点GMA转化组较同代龄DMSO组细胞全基因组甲基化水平降低,转化前期GMA组、DMSO组、5-aza-cdr组细胞甲基化水平较转化中期及转化后期相对应各组的全基因组甲基化水平低.结论 GMA诱导16HBE细胞在转化前期已出现全基因组低甲基化现象,故可将其视为细胞恶性转化前期生物标志.
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二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析
目的研究苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘(反式-BPDE)诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化的基因和蛋白表达的改变,探讨苯并(a)芘致癌的分子机制.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5～8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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氯化镉对人胚肺成纤维细胞的恶性转化作用
为研究氯化镉致人胚肺成纤维细胞的恶性转化作用,用染色体分析、3H-TdR掺入实验和流式细胞术检测了转化细胞染色体畸变、各细胞周期时相细胞的比例和DNA合成情况.结果显示,氯化镉在0.004μmol/L、0.02μmol/L、0.04 μmol/L 3个实验浓度都可使人胚肺成纤维细胞生长排列紊乱,失去方向性和密度调节作用,重叠生长,形成明显的转化灶;染色体发生畸变:数目增多或减少,结构出现断片、双着丝粒体;S期细胞比例增大;细胞DNA合成异常旺盛,其中实验组DNA合成量约为阴性对照组的2.4～3.8倍.
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苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化对DNA甲基化转移酶的影响
目的 研究苯并[a]芘(B[a]P)诱导的小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化过程对DNA甲基化转移酶(DNMTs)表达水平及活性的影响.方法 以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(pol β+/+)和BaP长期多次染毒构建的小鼠胚胎成纤维恶性转化细胞(pol β-T)为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot分别检测两种细胞中dnmts(dnmt1、dnmt3a和dnmt3b)的mRNA及蛋白表达水平,同时用DNA甲基转移酶活性/抑制分析试剂盒检测DNMTs的酶活性.结果 pol β-T细胞dnmt1和dnmt3b的mRNA相对表达量分别为(0.940±0.033)和(0.905±0.062),均高于pol β3+/+细胞[(0.560 ±0.031)和(0.666±0.041)],差异有统计学意义(P＜0.05).polβ-T细胞DNMT1和DNMT3b蛋白相对表达量分别为2.172±0.089和1.134±0.144,亦均高于pol β+/+细胞(1.311±0.050和0.820±0.106),差异具有统计学意义(P＜0.05).两种细胞DNMT3a蛋白和mRNA相对表达水平均无显著性差异.酶活性检测结果显示,与pol β+/+细胞[(329.48±52.11) OD·h-1·mg-1]相比,polβ-T细胞甲基化转移酶活性[253.70±20.56)OD·h-1·mg-1]降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 dnmt1和dnmt3b的异常表达以及DNMTs酶活性的改变可能参与苯并[a]芘诱导的细胞恶性转化过程.
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Nrf2信号通路在亚砷酸钠诱导支气管上皮细胞恶性转化中的作用
目的 构建亚砷酸钠(NaAsO2)诱导人支气管上皮(HBE)细胞恶性转化的模型,探讨核转录因子-E2类相关因子2(Nrf2)信号通路在恶性转化过程中的作用.方法 以2.5 μmol/L NaAsO2染毒HBE细胞,以四氮唑盐比色(MTT)法、克隆形成和划痕侵袭等实验鉴定细胞恶性转化;蛋白免疫印迹实验检测恶性转化过程中细胞内Nrf2及其下游靶基因醌氧化还原酶1(NQO1)和血红素单加氧酶-1(HO-1)的表达水平.结果 随NaAsO2染毒代数的增加,HBE细胞逐渐表现增殖失控,染毒25代(As-HBE-T25)和50代(As-HBE-T50)的克隆形成率分别为1.33％和4.47％,侵袭能力为正常HBE的2.04倍和4.17倍;同时,细胞浆和细胞核中的Nrf2表达水平均下降,As-HBE-T25细胞浆和细胞核中的Nrf2表达水平分别为正常HBE的0.83倍和0.81倍,As-HBE-T50为0.42倍和0.63倍;NQO1在As-HBE-T25和As-HBE-T50中的表达为正常HBE的0.84倍和0.59倍,HO-1则为0.75倍和0.48倍(P＜0.05).结论 NaAsO2慢性染毒诱导了人支气管上皮细胞恶性转化,可能的机制为NaAsO2持续抑制Nrf2信号通路,使NQO1和HO-1表达水平降低,从而引起细胞恶性增殖.
关键词： 恶性转化 核转录因子-E2类相关因子2 醌氧化还原酶1 血红素单 加氧酶-1 -
活性氧、丙二醛及超氧化物歧化酶在NaAsO2致人角质形成细胞恶性转化过程中的动态变化
目的 探讨氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)在砷致人角质形成细胞(human keratinocytes,HaCaT)恶性转化不同阶段的动态变化.方法 以含1.0 μmol/L NaAsO2的DMEM高糖完全培养基连续培养HaCaT细胞35代后,用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达水平变化、细胞生长动力学改变和软琼脂集落形成实验鉴定其是否发生恶性转化.分别收集0、1、7、14、21、28和35代细胞,采用流式细胞仪检测不同代数细胞内ROS活性,生化法检测细胞内MDA含量及SOD活性变化.结果 1.0μmol/L NaAsO2处理HaCaT细胞28代开始MMP-9相对蛋白水平明显上升,35代后细胞生长速度明显增快,倍增时间明显缩短;软琼脂集落形成数为(107±11)个,较对照组(24±7)明显增多(P＜0.01).ROS水平在染毒0到14代间呈先上升后下降随后再上升趋势,14代以后ROS水平逐渐降低.MDA含量在染毒1代时达到峰值,随后呈缓慢下降趋势.SOD活性在染毒0到21代呈先上升后缓慢下降趋势,21代以后其活性再次升高,呈持续上升趋势,且较0代明显升高(P＜0.05).结论 低剂量亚砷酸钠长期诱导HaCaT细胞发生恶性转化过程中伴随细胞内氧化-抗氧化平衡失调,染毒后期SOD活性持续增加而ROS水平持续降低.
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腮腺Warthin瘤上皮成分恶变为黏液表皮样癌的临床病理观察
目的 探讨Warthin瘤上皮成分恶变为黏液表皮样癌的临床病理特征、诊断及鉴别诊断.方法 分析Warthin瘤上皮成分恶变为黏液表皮样癌的病例1例,研究其临床病理形态学特点、免疫表型及组织化学染色特点.结果 患者男性,27岁,腮腺区无痛性肿物,肿物呈结节状,切面囊实性.镜下Warthin瘤瘤体内可见黏液表皮样癌结构,为低级别黏液表皮样癌,两者存在移形区.结论 Warthin瘤上皮成分恶变为黏液表皮样癌极为罕见,病理诊断主要依据组织学形态,明确的黏液表皮样癌形态及二者上皮成分存在移行,分子改变需要进一步研究观察.
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乙型肝-T炎病毒和黄曲霉素协同在裸鼠体内诱发人胎肝细胞癌变的研究
为了研究乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)和黄曲霉素(AFB1)在肝癌发生过程中的作用,用HBV感染的人胚胎肝细胞移植至裸鼠背部皮下,以后每周注射AFB1,能诱发裸鼠成瘤.实验分为4组:A组为HBV+AFB1组,即用HBV感染的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,同时注射ABF1;B组为HBV+组,用HBV感染的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,不注射AFB1;C组为AFB1+组,用不感染HBV的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,注射AFB1;D组为对照组,用H不感染HBV的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,也不注射AFB1.结果:A组成瘤率为27.3%(6/22),B组0%,C组13.3%(2/15),D组0%,所有肿瘤病理诊断均为肝细胞癌.用EMA单抗检测,证实为人来源细胞.PCR和DNA狭缝印迹显示:HBVX和u HBV S基因阳性,证明HBV基因已到瘤细胞中.实验首次用人乙肝病毒协同AFB1在裸鼠体内诱发成功人肝细胞癌,证明了 HBV协同AFB1在人肝细胞癌发生过程中的病因作用.同时,为进一步研究肝癌的发生及防治提供了良好的动物模型.
关键词： 人胚胎肝细胞 乙型肝炎病毒 黄曲霉素(AFB1) 恶性转化 -
人乳头状瘤病毒协同60钴照射促进食管上皮细胞恶性转化
为探明人乳头状瘤病毒(HPV)和促癌剂对食管上皮致癌作用,人胚食管上皮细胞转染HPV协同60钴(60Co)放射观察其恶性转化.用HPV18E6E7AAV转染的人胚食管上皮(SHEE),培养至13代,分为4组,实验组分别用60Co2、4、8Gy照射,每周1次共4周;SHEE未经照射为对照组.细胞形态用相差显微镜观察;细胞DNA合成和定量用3H-TdR掺入和用流式细胞仪分析;染色体众数用常规方法分析;致瘤性用软琼脂培养和裸小鼠接种;HPVDNA用PCR检测.经60Co照射后细胞呈凋亡和坏死(危象期).8周后SHEE 4Gy组细胞增殖,增殖指数(34%)和3H-TdR摄入增高,软琼脂培养和裸鼠接种出现致瘤性.对照组SHEE组细胞增殖指数24%,伴有少数3H-TdR掺入,裸鼠未成瘤.染色体众数:对照组,58～62;4Gy组,63～65;两组HPV18E6E7 PCR呈阳性条带.此结果表明,用HPV18E6E7协同60Coγ射线可以使人胚食管上皮恶性转化,60Co γ射线有加速食管上皮细胞恶性转化作用.
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人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化
为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞(SHEE)61代(SHEE61)部份细胞(SHEE61A)已经恶性转化,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法.对培养的SHEE第10代(SHEE10)和61代(SHEE61)细胞,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式;用流式细胞仪分析细胞周期;用染色体G带核型分析和间期核染色体1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交(FISH)检测细胞染色体改变;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体,接种裸小鼠和SCID小鼠.结果:光学显微镜下见SHEE61细胞大小不等,重叠生长;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型;流式细胞仪检测,SHEE61增殖指数和DNA＞4n细胞高于SHEE10;SHEE61细胞染色体众数出现57～60、63～65两亚群,1、7、9、13、17等染色体出现较多3体、4体或5体;FISH间期核1、7号着丝粒数增多;SHEE61克隆优选的细胞SHEE61A接种SCID小鼠成瘤.这表明:SHEE61细胞形态及生长特性有了改变,接触抑制减弱,高倍体和不整倍体细胞增多,染色体数目明显改变,SHEE61A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤,可以判定SHEE61部份细胞已恶性转化.用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化.
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人乳头瘤病毒16型E6和E7基因及其突变体转化活性的研究
为筛选出可用于研制HPV治疗性疫苗的HPV16型E6和E7基因突变体,故将HPV16型原型株(德国株)E6和E7基因及其各种突变体分别转染Balb/c3T3细胞,观察转染后的细胞在软琼脂培养中的集落形成能力和在裸鼠体内的成瘤能力.结果表明,单独转染和共转染HPV16野生型E6和E7基因的Balb/c3T3细胞系,在软琼脂中呈集落样生长,并在裸鼠体内成瘤;而转染E6基因突变体mE6(50G)、E7基因的两种突变体mE7-1(24G26G)和mE7-3(24G26G67R)以及共转染mE6和mE7-1的Balb/c3T3细胞,在软琼脂培养中极少形成集落,也不能在裸鼠体内成瘤.提示经结构改造后的HPV16 E6和E7基因已失去了对Balb/c3T3细胞的转化活性,而保留了免疫原性,可用于HPV16相关肿瘤治疗性疫苗的构建.
关键词： 人乳头状瘤病毒16型 诱变 恶性转化 Balb/c3T3细胞 -
STAT3异常激活对人脐带间充质干细胞在乳腺癌微环境中恶性转化的影响
目的：探讨人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）在MCF－7B乳腺癌微环境中是否存在恶性转变并探究其生物学变化与STAT3异常激活及高表达的关系。方法将hUCMSCs分为3组：空白对照组（ hUCMSCs单独培养）、实验组（hUCMSCs与MCF－7B共培养）和阳性对照组（MCF－7B单独培养）。倒置显微镜观察细胞形态变化；流式细胞术检测细胞周期；RT－qPCR检测STAT3及其下游原癌基因c－Myc及抗凋亡Bcl－xLmRNA的表达；细胞免疫荧光检测p－STAT3、c－Myc和Bcl－xL蛋白表达及定位；Western blot检测p－STAT3、STAT3、c－Myc和Bcl－xL蛋白表达。结果实验组hUCMSCs与对照组比较核质比增大，细胞大小不一，排列紊乱；实验组细胞G1期比例显著低于对照组（ P＜0．05），S期和G2期比例均显著高于对照组（P＜0．05）；实验组STAT3、c－Myc和Bcl－xLmRNA的表达均显著高于对照组（P＜0．05）；实验组p－STAT3、STAT3、c－Myc和Bcl－xL的蛋白表达水平显著高于对照组（P＜0．05），且主要定位于细胞核内。结论 hUCMSCs在MCF－7B乳腺癌微环境中存在恶性转化趋势，且STAT3的异常激活及高表达是hUCMSCs恶性转化的重要因素之一。
关键词： 人脐带间充质干细胞 恶性转化 信号传导与转录活化因子3
