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1-03 塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因突变
目的了解药物致癌过程中的基因突变情况.方法利用以塞替派为致癌原诱导永生化人支管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化建立的癌前转化细胞(BEAS-TE)以及从软琼脂上筛选到了克隆化多倍体细胞,沿转化细胞代龄进行了转化进程中p53、p16和Ki-ras基因突变情况的动态观察.结果 p53、Ki-ras基因存在多位点、p16基因单位点的的碱基突变.结论 p53和Ki-ras基因的多位点突变是塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,p16基因非编码区单个碱基的缺失是细胞转化过程中的次要分子事件.
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1-07 镍化合物诱发细胞恶变过程中P53基因突变
目的探讨3种镍化合物在诱发细胞恶变过程中不同阶段P53基因突变情况,并比较它们之间的差异.方法 3种镍化合物转化细胞接种BALB/c裸鼠,应用PCR-SSCP法进行肿瘤细胞和转化细胞P53基因第5~8外显子检测.结果硫化镍、氯化镍、硫酸镍分别诱发的转化细胞都在BALB/c裸鼠皮下形成肿瘤,病理组织学检查确定为纤维肉瘤.硫化镍组1个经软琼脂筛选的转化细胞系和相应的肿瘤细胞系P53基因第8外显子检出突变.氯化镍组的肿瘤细胞系第6外显子检出突变.结论 3种镍化合物所诱发的细胞转化为恶性转化,且都具有体内致瘤性.镍化合物诱发细胞恶变的晚期发生P53基因突变.
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1-02 塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化*
目的研究塞替派对人类上皮细胞的致癌转化效应.方法利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为基本细胞模型,首次进行了塞替派诱导BEAS-2B细胞的恶性转化实验;平行于细胞的转化进程研究了塞替派转化细胞(BEAS-TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征.结果经传代和软琼脂培养基筛选BEAS-TE已具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性,可能是具有较强裸鼠致瘤性的恶性转化细胞.结论塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应.
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1-01 c-Ha-rasV12G基因转染细胞系促癌剂检测模型
目的建立促癌剂检测模型.方法采用电穿孔的方法,将突变的c-Ha-rasV12G基因转入人胚肺成纤维细胞WI-38及人支气管上皮细胞BEAS-2B中,将获得的G418抗性(G418r)单克隆细胞株进行DNA-DOT-Bloting及RT-PCR分析后,进一步用促癌剂佛波醇酯(PMA)处理,并选用克隆形成率(CFE)、锚着独立性生长(AIG)、血清抗性及裸鼠成瘤性等表型改变对受试细胞进行了恶性程度检测.结果 c-Ha-rasV12G基因使细胞对促癌剂的促癌敏感性增强,其中,对于WI-38G418r细胞,当PMA剂量分别为0、3.125×10-5、6.25×10-5、1.25 × 10-4、2.5×10-4及0.5×10-3mol/L时,其在含体积分数为1%FBS的1640培养基中的克隆形成率分别为7、8、11、12、15及14/200 cells,在含体积分数为10%FBS的培养基中分别为76、92、106、109、127及173/200 cells,在质量浓度为0.33%的琼脂中为47、61、70、69、80及97/1 000 cells.选取0.5×10-3 mol/L剂量组处理的G418r细胞进行裸鼠成瘤性实验,结果阳性.对照非基因转染细胞,用0.5×10-3 mol/LPMA处理后,在3种培养基中相应的克隆形成情况为3、33/200 cells,0/1 000 cells,裸鼠皮下注射部位无肿瘤生长.PMA以0、2.0×10-5、1.0×10-4、5.0×10-4、1.0×10-3及1.6×10-3 mol/L分别作用24 h,结果1.0×10-4 mol/L剂量作用使BEAS-2B G418r细胞获得了高的血清抗性及CEF,表现为在含体积分数为0.8%、0%FBS的LHC-8培养基及软琼脂中的CEF分别为190%、150%及75%(对照非基因转染细胞在不含PMA及FBS的LHC-8中CEF计为100%),对照细胞在含体积分数为0.8%FBS的培养基及软琼脂中不能生长,随着PMA处理剂量的增加,其CFE逐渐降低.结论 c-Ha-rasV12G基因可使上皮细胞BEAS-2B获得对PMA的促癌作用敏感性,其中当PMA剂量≤1.0×10-4mol/L时,可发挥促癌作用,大于该剂量则有促分化作用;上皮细胞发生恶性转化的标志之一是细胞对FBS、PMA等促分化剂的促细胞分化抗性增强.
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NHE1基因调控细胞内酸碱平衡对胃癌细胞生物学行为的影响
目的:通过基因转染技术,研究NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞生物学行为的影响,探讨通过酸化细胞内环境诱导肿瘤细胞凋亡从而治疗胃癌的新方法.方法:利用亚克隆技术构建人NHE1反义结构基因哺乳动物真核表达质粒,通过DOTAP脂质体介导的转染技术将反义真核表达质粒和空载体分别转入SGC-7901胃癌细胞中,经聚合酶链反应(PCR)对转染基因的整合鉴定后,观察基因转染对细胞形态学、细胞内pH值、体外生长状况、细胞周期以及双层软琼脂克隆形成能力和裸鼠成瘤力的影响.结果:光镜及透射电镜下细胞形态恶性程度降低.Anti-7901细胞胞内pH值显著低于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞内pH值(6.77±0.05 vs 7.24±0.03,7.26±0.03,P<0.01).Anti-7901细胞生长速度明显减慢,出现接触抑制,呈单层生长,细胞凋亡率显著高于Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901凋亡率(26.1% vs 5.12%,4.48%,P<0.01).Anti-7901细胞在双层软琼脂中集落形成率显著低于Zeo-7901和空白对照组SGC-7901细胞(9±3.54‰ vs 40±4.53‰,38.6±4.63‰,P<0.01).接种Zeo-7901细胞和空白对照组SGC-7901细胞裸鼠皮下长出肿瘤,成瘤率为100%,而接种Anti-7901细胞裸鼠皮下未长出肿瘤,成瘤率为0%.结论:反义技术干预可使NHE1基因表达下调,导致细胞内酸化,诱导细胞凋亡,达到了有效治疗胃癌的目的,为胃癌基因治疗提供了新的思路.
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二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞生长的影响
目的:研究二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞生长的抑制作用.方法:采用MTT法、生长曲线分析、细胞活力检测、双层软琼脂集落形成率、及倒置显微镜等方法,观察DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞的影响.结果:DADS对MGC803细胞具有明显的生长抑制效应,且呈剂量-效应依赖关系(P<0.05).培养96 h,35 mg/LDADS的抑制作用呈时间-效应依赖关系(P<0.05).细胞群体倍增时间由33.8 h延长至DADS处理后的84.0 h(P<0.05);细胞存活率分别为阴性对照组97.4%和DADS处理组80.4%(P>0.05);软琼脂集落形成率由1.23%下降到0.33%(P<0.05).阴性对照组细胞多角形、圆形,体积大,多形性明显,核大小不一,见双核及核仁,细胞生长紧密呈堆叠生长.DADS处理后细胞异型性降低,为形态一致的梭形,体积小,境界清楚而分散,胞质丰富,核明显变小.结论:DADS对体外培养的MGC803细胞具有明显的增生抑制作用,且呈现剂量-效应依赖关系.
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单克隆抗体PD4相关抗原的鉴定
单克隆抗体PD4是本所用胃癌细胞系MGC803细胞免疫BALB/c小鼠,经细胞筛选而获得的[1]。前期工作证明,此抗体能引起MGC803细胞的凋亡[2], 抑制Ras转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力, 并降低其在裸鼠中的致瘤能力[3,4],这些结果提示,单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤的发生、发展及转归密切相关。因此,克隆PD4相关抗原基因,了解其结构及功能,将有助于我们认识肿瘤的发生发展及转归规律,为肿瘤的防治提供有益的线索和依据。
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炎症下调的miR-7促进胃癌发生
目的:检测miR-7在野生型、胃炎模型和胃癌模型小鼠胃组织及人胃癌组织和细胞株中的表达,探讨了其对胃癌发展中的作用及可能的机制。方法:实时荧光定量PCR法检测胃癌组织和胃炎组织中依赖性表达变化的miR-7的表达,并转染高表达miR-7的质粒制备高表达miR-7的AGS/miR-7细胞,检测其对胃癌细胞增殖和软琼脂克隆形成的影响。结果:胃炎组织中和胃癌组织中的miR-7的表达明显低于野生型小鼠胃组织,胃癌组织中的miR-7表达明显低于胃炎组织;幽门螺旋杆菌感染的小鼠胃组织miR-7的表达明显受抑制;高表达miR-7的AGS/miR-7细胞可明显抑制细胞的增殖和软琼脂克隆形成。结论:炎症可抑制miR-7的表达,下调的miR-7促进细胞增殖和软琼脂克隆形成是炎症促进胃癌发生可能的新机制。
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转化生长因子β的研究进展
转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)初的研究始于1978年,Delarco和Todaro发现小鼠肉瘤病毒转化3T3细胞系所产生的多肽因子可诱导非肿瘤细胞转化为失去接触抑制,获得具有在软琼脂层中生长能力的肿瘤细胞,当时称为肉瘤生长因子[1].后续研究发现某些人体肿瘤细胞也产生类似多肽因子,随后这些能刺激静止性生长的细胞呈非静止性生长的因子称为转化生长因子(TGF)[2].TGF包括TGF-α和TGF-β.两者名字类似,但结构和功能却截然不同.越来越多的证据表明,TGF除了能使正常细胞转化外,在细胞增殖、生长和分化等基本活动中行使多种重要的调节作用和其他生物学效应[3].
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三种不同生物学特性细胞在软琼脂中的生长表型分析
背景与目的 软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力,但很早就有人根据形态学变化用它来检测低等生物的生物学特性.本文探讨利用软琼脂集落形成实验这种方法进行哺乳动物癌细胞表型初步分析的可行性.方法 将三种不同生物学特性的细胞(小鼠成纤维细胞NIH3T3,高转移人肺腺癌细胞系Anip973,高浸润人肺腺癌细胞系L18)悬液接种到软琼脂中,分别在1天、5天、14天后观察细胞形态特征.结果 第五天开始细胞集落形态出现差异,14天时差异更显著.NIH3T3细胞克隆为椭圆形,中等大小,边界清楚;Anip973克隆周围有大量游走细胞,表现出其转移特性;L18细胞克隆分支多并向周围延伸扩展,与其浸润特性相符.结论 软琼脂分析实验是一种良好的根据表型来观察及鉴定哺乳动物细胞生物学特性的方法.