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不同胃癌细胞系中B7-H1分子的表达水平及定位
目的 通过检测胃癌细胞系SGC7901/VCR、SCC7901和BGC-823,以及永生化胃上皮细胞系GES中B7-H1的表达,探讨B7-H1与胃癌的发生及多药耐药(MDR)的关系.方法 上述细胞系培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中,利用RT-PCR技术、细胞免疫化学染色以及细胞免疫荧光染色技术与流式细胞术检测4种细胞系中B7-H1 mRNA与B7-H1蛋白的表达情况,并比较其在4种细胞系中的表达强度.结果 B7-H1 mRNA在4种细胞系中均有表达,表达强度按照GES-1、BGC-823、SGC-7901、SGC-7901/VCR的顺序递增;细胞免疫化学染色与免疫荧光染色表明,B7-H1蛋白主要表达在上述细胞的细胞膜和少量细胞浆中.结合流式细胞术检测进一步证实,B7-H1蛋白在4种细胞系中的表达结果与mRNA的表达一致.结论 B7-H1表达在胃上皮细胞上,可能通过抑制机体免疫反应,促进胃癌细胞生长及MDR基因表达.
关键词： B7-H1 多药耐药 逆转录-聚合酶链反应 胃癌细胞系 -
人类抗凋亡基因survivin的克隆及其原核表达
目的:克隆人类抗凋亡基因survivin(SVV),实现SVV基因在大肠杆菌中的高效表达.方法:提取胃癌细胞系SGC-7901总RNA,RT-PCR扩增人SVV全长cDNA,克隆于载体pGEM-T,酶切、测序鉴定.将人类SVV基因全长cDNA克隆入原核表达载体pRSET,实现该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达.结果:得到人SVV基因全长cDNA,经测序与SVV基因的已知序列相同,原核表达所获融合蛋白经SDS-PAGE电泳与已知SVV基因的蛋白质表达产物大小相近.结论:克隆出人SVV基因的全长cDNA,并克隆入原核表达载体pRSET,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.
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胃癌细胞nm23H1基因表达与体内外侵袭力的关系
目的:探讨nm23H1基因与胃癌细胞体内外侵袭力的关系.方法:采用Boyden小室法测定四种胃癌细胞系MKN1、MKN45、GT3TKB、BGC823的体外侵袭力,Northern印记杂交,RT-PCR及免疫组化技术检测胃癌组织、四种胃癌细胞系的nm23H1 mRNA及蛋白表达水平.结果:胃癌细胞体外侵袭力高低的顺序依次为MKN45高(33.1±5.2,与其他三种细胞系相比P＜0.01);BGC823(15.8±2.7),MKN1(14.1±4.5)次之(二者无显著差异,P＞0.05),GT3TKB低(6.3±2.5,与其他三种细胞系相比P＜0.01).nm23H1基因表达与胃癌细胞体内侵袭能力呈反比关系,nm23m基因表达与MKN45,BGC823,GT3TKB细胞体外侵袭力也呈反比关系,但与MKN1细胞体外侵袭力无明显关系.结论:nm23H1表达在评价胃癌细胞体内外侵袭力方面具有重要价值.
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乏氧对胃癌细胞系MGC803细胞周期、乏氧相关基因和蛋白表达的影响
目的:观察胃癌细胞系MGC803乏氧不同时间细胞周期、抑癌基因PTEN、线粒体ATP6(mtATP6)和线粒体Cyt-b(mtCyt-b)mRNA及VEGF、EGFR蛋白表达变化.方法:将MGC803细胞(1.0×1010/L)施加乏氧(10mL/LO2)处理0,2,8,16,24 h.应用RT-PCR,Western blot,流式细胞术对MGC803细胞进行检测.结果:MGC803细胞乏氧0,2,8,16,24 h时ATP6mRNA表达量为78.22%,69.28%,84.40%,39.84%,42.52%;Cyt-b mRNA为83.40%,75.87%,64.57%,79.05%,77.44%;PTEN mRNA为23.93%,26.52%,35.74%,40.31%,49.92%;VEGF蛋白表达量为16.1,16.5,18.2,20.6,27.5;EGFR蛋白为14.3,17.2,18.1,32.6,37.7.结果显示乏氧后ATP6 mRNA表达水平下降,8 h后又升高,以后随着时间的延长,ATP6 mRNA再次下降;Cyt-b mRNA乏氧8 h出现一过性下降,24 h又恢复到乏氧前水平;PTEN mRNA、VEGF和EGFR蛋白表达水平随乏氧时间延长也逐渐增加,乏氧24 h表达高;乏氧使MGC803细胞发生G1期阻滞,凋亡细胞增多,S期细胞减少,但24 h后细胞周期分布基本恢复至乏氧前水平,乏氧时间与MGC803细胞周期的改变无相关性(P＞0.05).结论:乏氧使MGC803细胞发生一过性G1期阻滞,增加PTEN mRNA和VEGF、EGFR蛋白表达,降低mtATP6mRNA的表达.
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吲哚美辛和、或顺铂对胃癌细胞凋亡的影响
目的:探讨吲哚美辛(indomethacin,IN)、顺铂(cisplatin,CDDP)对胃癌细胞株MGC803凋亡的影响,为寻求新的胃癌治疗策略提供理论依据.方法:MGC803细胞经IN、CDDP处理后,用MTT法检测药物对细胞增生的抑制;荧光染色检测细胞凋亡率;流式细胞仪测定细胞周期.结果:IN、CDDP均可抑制MGC803细胞的增生、并诱导其凋亡;IN对胃癌细胞系MGC803的作用有较强的量效和时效依赖关系;高浓度的CDDP(10 mg/L)对此胃癌细胞系有较强的时效依赖关系,而低浓度的CDDP(0.1 mg/L,1 mg/L)在作用24 h后,由于肿瘤细胞的耐药机制,细胞凋亡率不再发生改变;中等剂量IN(200umoL/L)加各种浓度CDDP对此胃癌细胞系也有较强的量效和时效依赖关系,且加IN后,低浓度的顺铂诱导凋亡作用接近于单独作用组高浓度顺铂的效用.结论:吲哚美辛与顺铂对胃癌细胞株MGC803有协同作用,IN可能能够对抗胃癌对化疗药物的耐药.
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胃癌细胞系幽门螺杆菌感染对金属蛋白酶表达的影响
目的:建立胃癌细胞系H.pylori感染动物转移体外模型,初步探讨H.pylori感染在胃癌转移过程中的可能作用及其机制.方法:将H.pylori活菌与胃癌细胞系BGC-823低转移细胞株C8细胞共培养后,行裸鼠接种,观察H.pylori感染组与未感染组移植瘤生长情况及裸鼠肝、肺转移情况,免疫组化检测两组移植瘤中MMP-2,MMP-3,TIMP-2及TIMP-3蛋白的表达.结果:H.pylori感染组移植瘤重量与未感染组比较有差异(P＜0.05),病理检查示感染组2个肺转移,而未感染组无转移.免疫组化结果示感染组MMP-2,MMP-3,TIMP-2,TIMP-3蛋白的表达阳性率分别为:77.8±9.6%,64.5±6.9%,57.6±12.2%,40.0±9.2%;而未感染组分别为61.2±9.7%,53.1±5.8%,54.3±10.9%,53.0±6.6%,二者比较除TIMP-3蛋白的表达无显著性差异外,MMP-2、MMP-3、TIMP-2蛋白的表达均有显著性差异(P＜0.05).结论:H.pylori感染能促使裸鼠移植瘤的生长及肺转移,建立了H.pylori感染与胃癌的动物转移体外模型;H.pylori感染可能通过促使转移正相关因子MMP-2、MMP-3表达增高,转移负相关因子TIMP-2蛋白表达降低,而在胃癌转移过程中发挥重要作用.
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足叶乙甙活化蛋白激酶B信号通路影响胃癌化疗效果的机制研究
我们以前的研究表明,某些化疗药可活化蛋白激酶B(PKB)信号通路,降低胃癌细胞对化疗的敏感性[1-2].然而,目前PKB通路在胃癌化疗过程中的作用及其作用机制还远未阐明.本研究采用化疗药足叶乙甙及PKB信号通路抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)作用于胃癌细胞系SGC7901和BGC823,观察它们对胃癌细胞的影响,以进一步探讨PKB信号通路对胃癌化疗效果的影响及其可能机制.
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切除修复交叉互补基因1表达与胃癌细胞株耐药关系的实验研究
切除修复交叉互补基因1 (excision repair cross complementing 1,ERCC1)是核苷酸切除修复途径的关键基因,其过度表达导致顺铂耐药[1].本研究通过检测不同胃癌细胞系中ERCC1的表达并观察其对顺铂的敏感性,了解ERCC1表达与顺铂耐药之间关系,并通过顺铂诱导胃癌SGC7901细胞后观察ERCC1表达的变化,为探讨胃癌耐药机制和指导临床的个性化治疗提供理论依据.
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5-FU对人胃癌细胞系p53β表达影响生物学意义探讨
目的:利用5-氟尿嘧啶-MKN45胃癌细胞系模型,研究p53β异构体表达的生物学意义.方法:不同浓度5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)作用于MKN45胃癌细胞系,MTT法检测细胞抑制率;巢式逆转录多聚酶链反应(nested Re-verse transcription-polymerase chain reaction,nRT-PCR)检测p53β、p53和Bax mRNA的表达变化.Pearson直线分析观察p53β表达水平与p53及Bax表达水平的相关性.结果:MTT检测结果显示,5-FU对MKN45的生长有显著的增殖抑制作用,且呈剂量和时间双效应,浓度为25、50和100 μg/mL的5-FU作用于MKN45细胞48 h后,抑制率分别为37.23％、59.54％和77.95％,差异有统计学意义,H=17.857,P＜0.01;浓度为25 μg/mL的5-FU作用于MKN45细胞24、48和72 h后,抑制率分别为17.43％、37.23％和78.09％,差异有统计学意义,F=19.108,P＜0.01.RT-PCR结果显示,MKN45细胞中p53β、p53和Bax mRNA表达均随5-FU浓度增加而增加,H值分别为15.118、19.785和21.963,P值均＜0.01.Pearson直线相关分析结果显示,p53β表达水平与p53表达水平呈显著正相关,r=0.976,P＜0.05;与Bax表达水平呈显著正相关,r=0.994,P＜0.01.结论:p53β异构体表现出与野生型p53协同作用于下游分子Bax的生物学功能,提示p53β异构体在p53诱导的肿瘤生长抑制效应中发挥重要作用.
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放射对乏氧胃癌细胞PTEN基因和VEGF等蛋白表达的影响
越来越多的证据表明乏氧可以诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR) 的表达,VEGF、EGFR与肿瘤的放射敏感性关系密切[1,2].笔者拟通过观察胃癌细胞系MGC 803乏氧不同时间后细胞周期、抑癌基因PTEN mRNA及VEGF、EGFR蛋白表达的变化及乏氧与乏氧照射后细胞存活情况,探讨乏氧时间对细胞放射后存活的影响.
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miR-485-3p通过靶向TLR1／NF-κB信号通路调节胃癌细胞放射敏感性
目的：研究miR?485?3p是否通过靶向TLR1对胃癌细胞放射敏感性起作用。方法分别用qRT?PCR和蛋白印迹法检测miR?485?3p和TLR1的表达变化，DIANA、TargetScan和miRanda软件预测和双荧光素酶报告实验验证 miR?485?3p 对 TLR1的靶向作用。将 miR?485?3p mimic 或TLR1 siRNA转染到胃癌MGC803细胞中，放射处理细胞，凋亡实验、克隆形成实验和MTT检测细胞放射敏感性的变化。双荧光素酶报告实验检测miR?485?3p上调和TLR1沉默对NF?κB活性的影响。蛋白免疫印迹实验探究miR?485?3p上调和TLR1沉默对NF?κB靶基因的影响。结果放射处理后胃癌细胞miR?485?3p表达下调，TLR1表达上调。靶基因预测软件发现TLR1可能是miR?485?3p的靶基因，双荧光素酶报告实验进一步验证了TLR1是miR?485?3p的直接靶点。 miR?485?3p负调控TLR1的表达。 miR?485?3p的过表达提高了细胞凋亡率，降低了细胞克隆形成和细胞群体增殖能力，增强了细胞的放射敏感性，且TLR1的沉默也具有相同作用。 miR?485?3p上调和TLR1沉默均降低了NF?κB的活性，下调了NF?κB多个靶基因的表达。结论 miR?485?3p可能通过靶向TLR1调控NF?κB信号通路增强胃癌细胞的放射敏感性。
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胃癌细胞uPA表达与腹膜种植潜能的相关性研究
目的探讨不同胃癌细胞系尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达及其与腹膜种植能力的关系.方法采用半定量RT-PCR、Western blot和ELISA方法,比较不同胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)uPA表达和uPA活性的差异.将胃癌细胞直接注入裸鼠腹腔,建立腹膜种植模型,通过观察裸鼠生存时间等方法,比较不同胃癌细胞系的腹膜种植潜能.结果 uPA表达以SGC7901细胞高,uPA活性以MKN45细胞高,AGS细胞uPA表达和活性均低.AGS未发生腹膜种植肿瘤;SGC7901和MKN45均出现大小不等的腹膜种植肿瘤;MKN28出现伴有血性腹水且大小相似的腹膜种植肿瘤;但MKN45早形成腹膜种植肿瘤,并且该组裸鼠的生存时间短.结论各株胃癌细胞的uPA表达在转录和翻译水平相一致,但uPA的表达量和uPA活性大小有明显差异,并且这二者与腹膜种植能力呈正相关.
关键词： 尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子 胃癌细胞系 腹膜种植 -
hTR反义PS-ODN联合顺铂对人胃癌裸鼠皮下移植瘤作用的体内研究
目的 探讨hTR反义寡脱氧核苷酸(ASODN)联合顺铂对人胃癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用.方法30只裸鼠建立胃癌皮下移植瘤模型后,随机分成5组,予以不同条件处理,对照组(瘤周注射RPMI1640培养液)、ASODN组(瘤周注射反义寡脱氧核苷酸)、RODN组(瘤周注射随机寡脱氧核苷酸)、DDP组(瘤周注射化疗药物顺铂)、ASODN+DDP组(瘤周注射反义寡脱氧核苷酸和顺铂).治疗后定期观察肿瘤体积,计算肿瘤抑制率.采用TRAP PCR-ELISA法检测移植瘤的端粒酶活性.结果ASODN+DDP组、ASODN组、DDP组和RODN组的高肿瘤抑制率分别为94.2%、843%,92.8%和26.9%.在端粒酶活性检测中,4个治疗组间均有统计学意义.结论hTR反义PS-ODN对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长及端粒酶活性有一定抑制作用,且可增强DDP的上述作用.
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低氧耐性胃癌细胞系的建立及生物学特征分析
目的 建立低氧耐性胃癌细胞系,并分析其生物学特征,为胃癌低氧微环境研究提供良好的模型.方法 通过逐渐降低氧气浓度建立耐受2％O2的低氧耐性胃癌细胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo.采用倒置显微镜观察细胞形态;采用Transwell小室检测细胞迁移能力;采用MTT法检测细胞增殖能力;采用免疫印迹法检测其蛋白表达;比较其与亲本胃癌细胞系的生物学特征差异.结果 与亲本胃癌细胞系比较,低氧耐性胃癌细胞系呈梭形改变,且排列松散,培养液颜色易变黄,迁移能力明显增强(P＜0.05),增殖能力减弱(P＞ 0.05);低氧相关指标HIF-2α明显上调,糖酵解相关指标Glut1显著上调,上皮间充质转化(EMT)相关指标ZO-1下调,vimentin上调;转移相关指标MUC1、integrin α5、integrin 31上调.结论 本研究建立了可耐受2％O2浓度的低氧耐性胃癌细胞系MGC803/hypo和BGC823/hypo,其转移能力明显增强,增殖能力相对减弱,这为探索低氧微环境促进肿瘤转移机制建立了良好的模型.
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单克隆抗体PD4相关抗原的鉴定
单克隆抗体PD4是本所用胃癌细胞系MGC803细胞免疫BALB/c小鼠，经细胞筛选而获得的［1］。前期工作证明，此抗体能引起MGC803细胞的凋亡［2］, 抑制Ras转化细胞Rat3-3在体外的增殖及在软琼脂中的集落形成能力, 并降低其在裸鼠中的致瘤能力［3，4］，这些结果提示，单克隆抗体PD4相关抗原与肿瘤的发生、发展及转归密切相关。因此，克隆PD4相关抗原基因，了解其结构及功能，将有助于我们认识肿瘤的发生发展及转归规律，为肿瘤的防治提供有益的线索和依据。
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磷脂酰肌醇3激酶p55γ调节亚单位对胃癌细胞系MGC803细胞迁移的影响
磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是生长因子信号通路的重要组成成分,调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等[1].PI3K信号通路的组成性活化不仅能导致细胞的恶性转化,而且还与肿瘤细胞的迁移、黏附以及肿瘤血管生成相关[2-4].p55γ是PI3K的调节亚单位之一,能与催化亚单位p110结合,在受胰岛素刺激时能结合胰岛素受体底物1(IRS-1)而表现PI3K的活性[5],但对其在生长因子信号转导和PI3K功能上的作用却不清楚.本实验研究p55γ的过表达对低分化胃黏液腺癌细胞系MGC803细胞运动、迁移等侵袭行为的影响,从而为阐明p55γ在细胞中的功能奠定基础.
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蟾蜍灵对人胃癌细胞系MGc-803的细胞毒作用
蟾蜍灵(bufalin)是我国传统中药蟾酥中蟾毒的主要成分之一,研究其抑癌作用及机制具有重要意义.采用台盼蓝染色法、噻唑蓝还原法和光镜观察bu falin对人低分化胃腺癌细胞系MGc-803的生长抑制作用.结果显示,0.01μmol/L及以上浓度bufalin对MGc-803细胞具有显著的抑制作用,IC50值约为0.1μmol/L.bufalin抑制MGc-803生长的机制是致使细胞核染色质凝缩、碎裂,DNA损伤,胞浆RNA含量下降,导致细胞死亡.
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氧自由基水平变化对体外培养胃癌细胞中P53、ras基因表达的影响
目的:观察H2O2、SOD和膜固思达对人胃癌细胞系MGC-803细胞P53、P21ras蛋白表达的影响,探讨氧自由基在胃癌发生发展中的作用.方法:通过对MGC-803细胞培养并给予一定浓度的H2O2、SOD和膜固思达以调节细胞内氧自由基水平,采用硫代巴比妥酸反应物质法检测细胞内氧自由基中间产物丙二醛(MDA)的含量,应用免疫组织化学技术检测细胞的P53、P21ras蛋白表达的情况.结果:H2O2使细胞内氧自由基水平升高,P53、P21ras蛋白表达增强(P＜0.01),SOD和膜固思达降低细胞内氧自由基水平,P53、P21ras蛋白表达减弱(P＜0.01).结论:H2O2、SOD和膜固思达可通过改变MGC-803细胞内氧自由基水平而影响其P53、P21ras蛋白的表达.
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EB病毒致胃癌形成的分子学机制研究进展
EB病毒是一种DNA肿瘤病毒,感染人类,可以引起鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤,近年来EB病毒与胃癌的关系也逐渐得到了人们的重视.EB病毒在人原代胃上皮细胞和胃癌细胞系中促癌作用已得到证实,但是它致胃上皮细胞增殖及胃癌形成的分子学机制仍不十分清楚.本文综述了国内、外这方面的研究进展.
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甲基化修饰对人胃癌细胞系中多种基因的调控
背景:甲基化紊乱与胃癌的发生有关,近年来甲基化已成为肿瘤研究的热点.目的:探讨在DNA甲基转移酶抑制剂5-氮脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-dC)的化学干预下,不同分化胃癌细胞系的抑癌基因、癌基因和与凋亡相关的基因与甲基化调控的关系,并辅以流式细胞仪检测细胞周期的变化.方法:培养高分化、中分化和未分化胃癌细胞系MKN-45、MKN-28和HGC-27,分别以不同浓度的5-aza-dC干预细胞.提取细胞的RNA,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测p16INK4A、p21WAF1、p73、c-myc、c-Ha-ras、survivin和死亡相关蛋白激酶(DAP-ki-nase)等多种基因的表达情况;同时以流式细胞仪分析细胞周期的变化.结果:抑癌基因中,MKN-45和HGC-27细胞中有p16INK4A表达,用5-aza-dC干预后其表达增强,MKN-45细胞的p16INK4A在5-aza-dC 10μmol/L 24 h、2μmol/L72h和5μmol/L 72h组表达增强,HGC-27细胞的p16INK4A在5μmo1/L 24h和10μmol/L 24h组表达也有明显增强;p21WAF1、p73无明显变化.癌基因中c-myc、c-Ha-ras变化不明显.与凋亡相关的基因中,MKN-45细胞的survivin在5-aza-dC处理后表达增强,但HGC-27细胞的DAP-kinase无明显变化.结论:在不同分化的人胃癌细胞系中,甲基化修饰对抑癌基因、癌基因以及与凋亡相关基因的调控有明显差异.p16INK4A基因在MKN-45和HGC-27细胞中、survivin基因在MKN-45细胞中的表达受DNA甲基化调控,在MKN-28细胞中则无表达.
