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温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染状况调查
目的 调查温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力因子的携带与耐药情况.方法 采用分层随机抽样的方法,对2008-2011年抽取的231份食品样品,用免疫磁珠富集法对大肠杆菌O157∶H7进行分离,对该分离株进行生化、血清学鉴定,以纸片法(K-B法)进行药敏试验;采用PCR方法检测O、H抗原基因和stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因.结果 231份样品中,分离出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为0.43%;O157抗原和H7抗原的核酸检测结果阳性,但未检测到stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因,菌株对红霉素、利福平、150μg/片和10 μg/片两种浓度的0/129(二氨基二异丙基喋啶磷酸盐)耐药.结论 温州市食品中存在大肠杆菌O157∶H7的污染,检出率较低,但提示要加强主动监测,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157∶H7所致食源性疾病的发生.
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中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆
人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)感染与宫颈癌的发生有密切关系.研究发现,HPV16早期蛋白E6是肿瘤相关抗原,可在HPV相关肿瘤中持续表达,为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位.但也有文献报道,宫颈癌中HPV16E6基因可有一定的变异性,变异株可逃避机体体液和细胞免疫的攻击,给相应疫苗研制带来困难.为制定合理、有效的疫苗设计策略,本研究选择去除氨基端转化活性的HPV16E6羧基(C)端基因片段(nt254-559)作为构建疫苗的抗原基因,对我国妇女宫颈癌组织中E6C基因片段的序列进行分析,并在此基础上进行E6C的分子克隆,以期为宫颈癌HPV16E6DNA疫苗的研制提供资料.
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A型肉毒毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的表达与鉴定
肉毒毒素(BoNT)是由肉毒梭菌在厌氧环境中产生的外毒素,有7个血清型(A~G),通过作用于神经肌肉接头的感受器,阻碍乙酰胆碱的正常释放,而引起肌肉驰缓性麻痹、呼吸肌麻痹[1].
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嗜肺军团菌PAL抗原基因的克隆及原核表达
军团菌病( Legionella disease)是由军团菌( Legionella)引起的以非典型肺炎为主要表现的多系统损害的急性细菌性传染病。此菌及其代谢产物可损害人体的多个脏器,严重影响肺、脾、肾、消化道和中枢神经系统功能。在迄今为止的40年间,此病发病率逐年上升,对人类健康的威胁日趋严重。在军团菌病的临床治疗过程中,早期治疗使用喹诺酮类或大环内酯类药物,疗效非常显著,但如若未能及时治疗,则死亡率可高达50%[1]。目前已确认的军团菌就有近60个种,70多个血清型[2],其中能引起人类致病的约30种[3]。在早期诊断时,通常采用生化和血清学检验方法,但由于只能检测军团菌中的嗜肺军团菌( Legionella pneumophila, Lp),极易出现漏诊,延误治疗时间。因此,研究探索军团菌病的广谱抗原并实现其基因的克隆及原核表达,是实现军团菌病早期快速、有效诊断的关键。
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HBV抗原基因修饰树突状细胞疫苗体外抗HBV的研究
慢性乙型肝炎产生免疫耐受的原因之一是患者体内抗原提呈细胞不正常,尤其是树突状细胞(DCs)数量减少和功能存在缺陷,不能将抗原信号有效提呈给机体的免疫系统而发挥免疫清除效应.本研究利用整合HBV基因组的HepG2 22.1.5为细胞模型,通过携带编码HBV抗原基因的重组腺病毒载体的介导,探讨腺病毒介导的HBV抗原基因修饰的DCs能否诱导产生特异性抗感染免疫反应,为慢性乙型肝炎的治疗探索一种新的免疫治疗措施.
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肝门型童虫免疫血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库
近年来,血吸虫疫苗研究进展迅速,国内外学者克隆表达了一系列血吸虫抗原基因,但至今它们在动物宿主体内诱导的保护性免疫未达到降低虫荷40%或更多预期的研究目的[1].因此继续筛选新的血吸虫疫苗候选分子成为当前血吸虫病研究的热点之一.我们用日本血吸虫肝门型童虫表膜抗原(SjHmAg)免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,以期发现特异的具有保护作用的日本血吸虫抗原基因,为血吸虫疫苗的研究提供新的候选分子.
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解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测序及其在大肠埃希菌中的表达
我们采用基因工程方法对解脲脲原体(Uu)标准株4型MB抗原基因进行体外扩增、测序及表达,为Uu疫苗和快速诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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cisAB01等位基因的鉴定及分子机制研究
顺式AB( cisAB)血型是ABO亚型中特殊的,而且相对常见的一种表现型,是ABO血型表观遗传学不符合孟德尔规律的AB亚型,可表现为O型父亲(母亲)和AB型的子女[1]。定型上可表现为ABO血型正反定型不符,从而导致ABO血型鉴定和配血困难,以及父权纠纷等问题。在胎母免疫方面也曾有cisAB血型引起ABO新生儿溶血病的报道[2]。对cisAB血型分子机制的研究有利于正确认识cisAB血型及其检测方法的改进,在安全输血、器官移植、产前胎儿ABO-HDN预测以及亲子鉴定等方面具有十分重要的作用。cisAB血型在NCBI中血型抗原基因突变数据库( BGMUT )中注册的等位基因有9种[3],其分子机制尚未完全阐明。
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大肠埃希菌O157:H7菌体抗原基因检测芯片的制备
为探讨大肠埃希菌O157:H7菌体抗原基因检测芯片的制备方法,为进一步研制O157:H7诊断芯片奠定基础.
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应用重组抗原诊断弓形虫病的研究进展
随着分子生物学的发展,对弓形虫重组抗原的研究取得了一系列的进展,多种弓形虫抗原基因通过基因工程手段得以表达并应用于弓形虫防治研究,这些抗原包括膜表面抗原(surface antigen,SAGs)、致密颗粒蛋白(dense granule proteins, GRAs)、棒状颗粒蛋白(rhoptry proteins,ROPs)、微线体蛋白(microneme proteins,MICs)以及基质抗原等[1]。重组抗原在弓形虫病诊断方面的研究一直存在两个方面,一方面是针对每一种抗原进行单独研究以确定其免疫特性,是筛选高效诊断抗原的主要途径,同时对于弓形虫感染机制等方面的研究也有重要意义;另一方面是针对复合抗原的研究以期望克服单一抗原在免疫诊断中的不足,优化得到佳的抗原组合,达到佳的诊断结果。当前人们对于弓形虫重组抗原的研究主要集中于两个方向,一是利用抗原性进行弓形虫免疫学检测,二是利用免疫原性用作疫苗进行免疫保护,本文就弓形虫重组抗原在弓形虫免疫诊断中的新研究进展做一综述。
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前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响
目的:探讨前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响.方法:采用常规PCR法从adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBV S和前S2+S基因片段,重组到VR1012载体中,转染COS-7细胞并免疫BALB/C小鼠.采用蛋白印迹、ELISA,ELISPOT等方法检测其在COS-7细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫.结果:转染的COS-7细胞表达相应的目的蛋白,且前S2+S转染的细胞表达明显高于S转染的细胞的表达;免疫接种小鼠后2 wk产生HBSAb及HBsAg特异性CTL,前S2+S抗原免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL均强于S抗原免疫.结论:前S2抗原基因可增强乙型肝炎DNA疫苗刺激的免疫应答.
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SMART技术构建人肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库
目的:构建肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库.方法:从肝癌细胞提取总RNA,纯化mRNA,用逆转录酶链式反应(RT-PCR)反转录合成cDNA第1链,LD-PCR合成cDNA第2链,除去<500 bp小片段,与λTripLEx2噬茵体载体连接并体外包装,转化大肠感菌E.coli XL1-blue,测定文库的库容和重组率,PCR鉴定插入cDNA片段大小.结果:构建的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,原始库容为3.4X 106 pfu/mL,重组率为98.2%;文库扩增后库容为9.6×108 pfu/mL,重组率为97.2%.重组子插入cDNA片段大小0.6-2(平均1.4)kb.结论:成功构建高质量的肝癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,为肝癌特异性抗原的筛选和鉴定奠定了基础.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBxAg的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤T细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物Ib抗原基因3个,白细胞抗原CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和DNA损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒X蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBxAg的生物学作用提供了新的线索.
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人源性大肠癌抗原基因的SEREX筛选
目的:寻找人源性大肠癌相关抗原基因.方法:构建3个以入Tripl Ex2噬菌体作载体的大肠癌抗原cDNA表达文库,用自体或异体大肠癌患者血清应用SEREX方法进行免疫筛选.用平板法扩增阳性克隆噬菌体,提取纯化DNA,用SfiI酶切和PCR鉴定插入片段的大小.结果:构建成3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,滴度分别为2.39×106nfu/L,2.07×106nfu/L和1.86×106nfu/L,插入片段长度为0.5-4kb,平均分别为1.4kb,1.6kb和1.3kb.筛选发现4个阳性克隆,插入cDNA片段大小分别为2.4 kb,1.8 kb,2.3 kb和2.2 kb.结论:用SEREX方法筛选大肠癌抗原cDNA表达文库,可获得有价值的大肠癌的重组抗原基因克隆,将有利于大肠癌的早期诊断和重组疫苗的研究.
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暴发性1型糖尿病:亟需关注的新病种
暴发性1型糖尿病(fulminant type 1 diabetes)是日本学者今川彰久等于2000年提出的一种1型糖尿病亚型.该病发病时B细胞破坏速度、高血糖症和酮症酸中毒进展极其迅速.发病机理有待阐明,但是,基因背景(特别是人类白细胞抗原基因)和病毒被认为与该病发病相关.暴发性1型糖尿病具有以下临床特征:高血糖症持续时间平均4天;发病前驱流感样和胃肠症状高发;虽然会出现与酮症酸中毒相关的严重高血糖,但是A 1 C水平接近正常;该病有时与妊娠有关;血清胰酶水平升高, C肽缺如,检测不到B细胞成分相关性自身抗体.一旦怀疑该病,必须立即开始糖尿病酮症酸中毒的治疗,具体方法与治疗其他类型的1型糖尿病酮症酸中毒一样.否则,患者可能在24小时内死亡.所有医务工作者都必须谨记,这种快速进展的糖尿病确实存在,要特别留意,不容漏诊.
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SiSo细胞表达的受体结合型癌抗原基因与胰腺癌
SiSo细胞系表达的受体结合型癌抗原(receptor-binding cancer antigen expressed on siso cells,RCAS1)可出现在多种不同类型肿瘤细胞表面,与肿瘤的分化、侵袭和转移有关,并提示预后不良.本文就RCAS1与胰腺癌的关系作一综述.
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青海地区汉、回族人群前列腺干细胞抗原基因rs2976392位点多态性与胃癌的遗传易感性
从世界范围看,我国属胃癌高发区,每年新发病例占全球的42%,胃癌死亡率在世界范围属于高水平,平均年死亡率为16/10万,其中高发区可达60/10万[1].青海省是我国胃癌高发区之一,回族是青海省主要的民族群体之一,其胃癌发病率较高,且发病特点与汉族不同[2],国内外对回族的胃癌研究尚很少.2008年千年基因组计划癌症研究组报道,前列腺干细胞抗原( PSCA)的基因多态性与日本弥漫型胃癌易感性相关.本研究拟初步探讨青海地区汉族和回族人群中PSCA基因rs2976392位点的基因多态性与胃癌易感性的关系.
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Ad-PSMA转染树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养抗前列腺癌的实验研究
我们前期成功构建了携带前列腺特异性膜抗原基因的复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA~([1]),本研究将Ad-PSMA转染树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,评价效应细胞抗前列腺癌(PCa)的生物学效应.
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胚胎单个卵裂球人类白细胞抗原基因的检测及意义
单细胞PCR技术用于胚胎植入前单基因遗传疾病的诊断已经取得成功,并且应用于对单个卵裂球人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)基因的检测[1,2].本研究探讨单个卵裂球HLA基因的检测方法及意义.
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型特异性荧光定量RT-PCR和基因进化分析在呼吸道合胞病毒感染诊断中的应用
呼吸道合胞病毒(RSV)是引起冬春季婴幼儿下呼吸道感染重要、常见的病原体之一,在婴幼儿中易引起大规模的暴发流行[1].2005年底浙江省某地妇儿医院报告婴幼儿肺炎病例骤增,2005年12月-2006年1月间我们对当地医院采集的24例急性期患者的鼻咽吸引物标本进行型特异性RSV荧光定量RT-PCR、免疫荧光法快速检测,并进行病毒分离和主要抗原基因的进化分析.