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同位素标记相对和绝对定量技术筛选石房蛤毒素毒性分子学研究
目的 应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术筛选麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)中石房蛤毒素(saxitoxins,STX)的差异表达蛋白.方法 以小鼠神经母细胞瘤N2a为受试对象,使用浓度分别为10-8 mol/L和10-9 mol/L的STX标准品和阳性对照NSP(10-10 mol/L)进行染毒.提取细胞蛋白、定量和酶解.iTRAQ标记后(其中114标记空白组、115标记浓度组1 (STX10-8 mol/L)、116标记浓度组2(STX10-9 mol/L)、117标记阳性对照组(NSP10-10 mol/L)),进行LC-MS/MS分析.使用生物信息学方法对差异蛋白进行分析.结果 与空白组相比,共筛选出184个差异表达蛋白.与PSP相关的蛋白共有22个.筛选出的差异表达蛋白参与10种生物学过程、4种分子类型.结论 通过iTRAQ技术分析得到STX的差异表达蛋白,发现ABCB6、TLR8、TES、TIAM2可能是与STX毒素相关的蛋白分子.
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刺五加Actin基因cDNA全长序列的克隆与生物信息学分析
目的：克隆刺五加Actin基因的全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析。方法：以刺五加的叶片为材料，提取总RNA，逆转录为cDNA，根据初步克隆到的刺五加Actin基因保守序列设计引物，利用套式PCR进行3'和5'RACE扩增，得到Actin基因的3'和5'端cDNA序列片段，拼接获得cDNA全长。将该序列进行BLAST比对、相似度分析，并对刺五加Actin1蛋白的二级结构和三级结构进行预测。结果：刺五加的Actin基因全长1507 bp，命名为ESA ctin1，注册号KC469585。该基因开放阅读框（ORF）长1134 bp，编码377个氨基酸，5'端非编码区长140 bp，3'端非编码区长233 bp。ESActin1与GenBank 中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在75%以上，蛋白质序列的相似性在94%以上。结论：首次报道了刺五加Actin基因的全长cDNA序列，为刺五加的分子生物学研究奠定基础。
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珊瑚菜Gl4CL基因克隆与生物信息学分析
目的:对珊瑚菜(Glehnia littoralis)4-香豆酸:辅酸A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,Gl4CL)基因编码区进行克隆及序列分析.方法:本研究在前期珊瑚菜高通量测序的基础上,利用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法对Gl4CL基因全长cDNA序列进行克隆.对Gl4CL蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析.利用实时荧光定量PCR方法检测Gl4CL基因在珊瑚菜的根、叶中的表达情况.结果:Gl4CL基因cDNA序列全长1 951 bp,编码544个氨基酸,其中开放阅读框1 635 bp,5'非编码区153 bp,3'非编码区163 bp.生物信息学分析表明,G14CL蛋白大小约为59.481 kDa,等电点为8.20.Gl4CL基因在珊瑚菜的根和叶均存在表达,且在根中表达量显著高于叶.结论:本研究为进一步开展Gl4CL基因功能和遗传调控研究奠定基础,通过深入探讨Gl4CL基因的表达调控与木质素、植株生长表型等关系,有望获得抗病虫害、抗逆性强的北沙参高产优质品系.
关键词： 珊瑚菜 4-香豆酸:辅酸A连接酶 基因克隆 生物信息学分析 -
华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析
目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析.方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等对其进行了生物信息学分析.结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的cDNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80％以上.结论:获得了AsPAL cDNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础.
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滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析
目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoAreductase,HMGR)基因的cDNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析.方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因cDNA全长.构建pEASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达.利用生物信息学方法分析克隆到的cDNA序列并预测结构和功能.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况.结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR cDNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR cDNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2.SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白.Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系为相近.结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上.HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量高的是叶.结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础.
关键词： 滇龙胆 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 基因克隆 原核表达 生物信息学分析 -
青蒿P450 cDNA基因的克隆及生物信息学分析
目的:对青蒿P450 cDNA基因进行克隆和生物信息学分析.方法:通过RT-PCR,从青蒿cDNA中克隆了1个P450基因;通过生物信息学方法,对其结构特点进行分析.结果:该P450 cDNA基因ORF为1 464 bp,编码488个氨基酸,该序列在GenBank上的登录号为DQ667171.编码蛋白是一个中等大小的A型P450,相对分子质量54.992 kDa;等电点8.83,定位于线粒体,和CYP71AV1具有很高的同源性.结论:该青蒿P450和CYP71AV1在进化和性质上很接近,可能在青蒿中执行类似功能.
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基于新疆紫草转录组的对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)基因的挖掘及生物信息学分析
对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)在紫草素类化合物的生物合成途径中起重要作用.该文主要通过生物信息学的方法从新疆紫草转录组中获得6个PGT基因,并预测其编码蛋白的理化性质,进行相关基因的表达分析.结构域预测结果显示,6个PGT蛋白序列均包含UbiA异戊烯基转移酶家族保守结构域及异戊烯焦磷酸结合位点NDxxDxxxD和可能的芳环的结合位点GX(K/Y)STAL;系统进化树分析显示PGT与同源的对羟基苯甲酸多异戊烯转移酶(PPT)属于2个不同的进化枝;基因表达分析表明在紫草素类化合物产量较高的新疆紫草红色高产系悬浮细胞及植株的地下部分,其PGT基因的表达量明显高于白色低产系及植株的地上部分,说明新疆紫草PGT基因的表达量与紫草素类化合物的合成呈正相关.该研究为进一步了解对羟基苯甲酸香叶基转移酶(PGT)的功能及特性奠定了基础,并为紫草素类化合物生物合成及代谢调控提供依据.
关键词： 新疆紫草 对羟基苯甲酸香叶基转移酶 生物信息学分析 实时荧光定量 -
雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析
研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyl-transferase)基因TwAACT进行全长cDNA(GeneBank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析.克隆得到TwAACT cDNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 kDa,在线预测表明TwAACT具有2个催化活性位点.雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,TwAACT相对表达量明显增加,在24h达到高.研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础.
关键词： 雷公藤 乙酰CoA酰基转移酶 克隆 生物信息学分析 基因表达分析 -
丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析
根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导丹参毛状根不同时期的SmKOL表达水平.克隆得到的SmKOL全长cDNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 kDa,等电点pI 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受MeJA诱导后,表达水平在36 h时达到大值.从丹参毛状根中克隆得到1条SmKOL全长cDNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因.
关键词： 丹参 类贝壳杉烯氧化酶 cDNA末端快速扩增 生物信息学分析 -
黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达
该文从黄芩叶中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了葡萄糖醛酸水解酶基因(sbGUS)的全长(GeneBank登录号KR364726).该基因全长1 584 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码527个氨基酸,为不稳定亲水蛋白.生物信息学分析结果显示sbGUS编码蛋白分子质量为58.724 8 kDa,等电点pI 5.55,含有信号肽和1个跨膜区,具有1个水解酶超级家族结构域1个未整合的转移糖苷酶催化结构域.二级结构中α-螺旋(Alpha helix)占25.62％,延伸链(extended strand)占28.84％,β-转角(Beta turm)占13.28％,无规卷曲(random coil)占32.26％.序列比对和系统进化分析表明,sbGUS基因与黄芩(BAA97804.1)核苷酸相似性为98.93％、氨基酸相似性为98.29％,在9个位置氨基酸不同.实时荧光定量PCR检测sbGUS在根中表达丰度高,其次为花和茎,在叶中表达量低.这为进一步鉴定sbGUS的功能及开展黄芩素的合成生物学研究奠定基础.
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红花黄酮醇合酶基因的全长cDNA克隆及植物表达载体的构建
黄酮醇合酶(flavonol synthase,FLS)是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一.本文在红花转录组测序结果中获得中间序列的基础上,采用RT-PCR和RACE技术,从我国传统中药材红花花瓣中克隆到黄酮醇合酶基因的全长cDNA.该基因全长1 201 bp,开放阅读框1 011 bp,编码336个氨基酸.系统进化分析表明,红花FLS基因编码氨基酸与同属菊科植物氨基酸具有一定的同源性,其中与金光菊的亲缘关系近.通过分子生物学方法,成功构建pBASTA-FLS植物表达载体.为后续研究该基因的生物功能及黄酮化合物合成机制奠定了基础.
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雷公藤4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析
4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一.根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞后0～ 72 hTwCMK基因的表达水平.结果表明,TwCMK全长 cDNA由1 732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 kDa,理论等电点为5.79;TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到高值.为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础.
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樟树4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的克隆及表达分析
4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK)是植物萜类化合物生物合成途径甲基赤藓醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway,DXP/MEP)上的第4个关键酶.该研究根据樟树转录组数据,利用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从药用植物樟树Cinnamomum camphora中克隆得到4-二.磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因,命名为CcCMK1(GeneBank登录号Ku376098),对其序列进行生物信息学分析,结果表明该基因开放阅读框(ORF)为1 212 bp,编码403个氨基酸,推测其相对分子质量为44.46 kDa,等电点(theoretical pI)为4.99.跨膜结构分析表明CMK蛋白不存在跨膜结构.信号肽分析表明其为非分泌蛋白,不存在信号肽.亚细胞定位表明其定位于叶绿体中.利用荧光实时PCR检测了龙脑樟、油樟、芳樟、脑樟和异樟5种化学型樟树中CcCMK1基因的表达量,结果表明CcCMK1基因在油樟中的表达量高,龙脑樟中表达量低,为樟树萜类化合物生物合成途径关键酶基因元件挖掘提供研究基础.
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雷公藤牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因全长cDNA的获得及生物信息学分析
该研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从雷公藤悬浮细胞中克隆得到一条GGPPS全长cDNA(GeneBank:KM978333),并对其进行多重序列比对、蛋白结构预测及构建系统进化树等生物信息学分析.所克隆的TwGGPPS cDNA全长1 857 bp,编码含514个氨基酸的蛋白序列,相对分子质量为57.13 kDa,等电点为7.85,具有5个保守域和2个功能域,亚细胞定位预测显示其可能位于质膜上,多重序列比对及系统进化树结果显示与其他植物GGPPS家族具有较高同源性.实验首次克隆了雷公藤GGPPS基因,为进一步研究雷公藤甲素等二萜化合物生物合成途径奠定基础.
关键词： 雷公藤 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 克隆 生物信息学分析 -
雷公藤贝壳杉烯酸氧化酶基因的全长cDNA克隆与表达分析
贝壳杉烯酸氧化酶(kaurenoic acid oxidase)是二萜赤霉素生物合成途径上的关键酶,参与植物生长发育等重要生物学过程.该文根据雷公藤转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术克隆得到贝壳杉烯酸氧化酶全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;使用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因的诱导表达水平.克隆得到TwKAO长度为1 874 bp,编码487个氨基酸,蛋白相对分子质量56.02 kDa,理论等电点8.89;经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwKAO基因相对表达量在12 h达到峰值;经植株组织表达分析证实,TwKAO基因在雷公藤的叶中表达量高,根中低.该研究首次克隆得到雷公藤KAO基因,并分析其mRNA表达特征,为深入研究雷公藤生长发育以及萜类活性成分次生代谢研究奠定基础.
关键词： 雷公藤 贝壳杉烯酸氧化酶(KAO) 克隆 生物信息学分析 表达分析 -
铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析
目的:揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础.方法:根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列.预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析.结果:核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸.氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性.冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达.结论:首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础.
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丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析
目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析；同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53；实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.
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雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析
该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS.其完整开放阅读框为1 797 bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75 kDa、理论等电点为5.37.生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族.实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到高.此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
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雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析
根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究.首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础.
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小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究
根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynzUGT).该基因cDNA全长1598 bp,由66 bp 5'-UTR,1440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynzUGT),其相对分子质量和等电点分别为54826.67 Da和5.82.利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38％)、β折叠片(12.1％)和无规蜷曲(49.9％),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋.通过系统进化树分析发现,xynzUGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用.SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58370.57 Da的xynzUGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在.利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达.以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础.
