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脑脉络丛组织中锰毒性差异表达蛋白的体外验证
目的 本实验室前期研究在锰染毒体内实验模型的大鼠脑脉络丛组织中鉴定到32个锰毒性相关的差异蛋白.本试验挑选出其中7个差异表达蛋白,包括抑制素蛋白(PHB1)电压阴离子通道(VDAC)、肌动蛋白β亚型(β-Actin)、应激性磷蛋白1(STI1)、热休克蛋白70(HSP70)、转甲状腺素蛋白(TTR)和中间丝波形蛋白(Vimentin),在大鼠永生化脉络丛上皮Z310细胞体外染锰模型中,对其蛋白和mRNA水平的变化趋势进行验证.方法 氯化锰(0、50、100和200 μmol/1)染毒Z310细胞24 h,采用蛋白印迹法(Western Blot)测定7个锰毒性相关蛋白的蛋白表达水平；同样剂量的氯化锰染毒Z310细胞12 h,以实时定量逆转录聚合酶链式反应法(Real time-RT PCR)测定7个蛋白在mRNA水平的表达情况.结果 随着剂量的增加PHBI、β-Actin和STIP1在蛋白表达与mRNA水平均表现为上调的效应趋势,VDAC、HSP70、TTR和Vimentin在蛋白表达与mRNA水平均表现为下调的效应趋势；PHB1、β-actin、STIP1和TTR在Z310细胞中的表达效应趋势与体内动物模型脑脉络丛中锰毒性差异蛋白的变化趋势相符,而VDAC、HSP70和Vimentin在Z310细胞中的表达效应趋势则与之相反.结论 氯化锰对PHB1、B-actin、STIP1和TTR的毒性效应在体内和体外是一致的,染锰后其蛋白表达和mRNA水平的变化趋势是可靠准确的.这为开展锰致脑脉络丛组织及其上皮细胞的毒性效应及其分子机制研究提供了有价值的线索.
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三氯乙烯对L-02肝细胞活力及SET蛋白表达的影响
三氯乙烯( Trichloroethylene,TCE)是工业上广泛应用的一种有机溶剂,主要通过呼吸道和皮肤进入人体产生职业性危害,吸收后主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官.SET蛋白,又称I2PP2A或TAF-1β,1992年因首次鉴于伴有SET基因染色体易位的未分化型白血病患者SE而命名[1],该蛋白在细胞中广泛存在.SET是肿瘤抑制因子蛋白磷酸酶2A( protein phosphatase 2A,PP2A)的胞内抑制蛋白,有文献报道SET抑制组蛋白乙酰化参与转录[2].但目前尚不清楚SET蛋白在TCE致肝细胞毒性中的作用.本文以人正常肝细胞L-02为受试细胞,建立了TCE致L-02肝细胞的剂量-效应关系,同时研究了TCE对SET蛋白表达变化的影响,为探讨TCE致肝损害发病机理及其治疗提供科学依据.
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大鼠急性肺栓塞后cytokeratin-19表达下降
目的 研究急性肺血栓栓塞大鼠的肺组织中细胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)及其分解产物CYFRA21-1的表达变化.方法 建立大鼠急性肺血栓栓塞模型并做肺泡灌洗.用半定量RT-PCR法和Western blot法检测CK-19的mRNA和蛋白表达;免疫组化方法检测CK-19在肺组织内的分布;放免法检测血清和肺泡灌洗液中CYFRA21-1的水平;检测动脉血氧饱和度.结果 急性肺栓塞后CK-19 mRNA和蛋白质水平均逐渐降低;肺泡上皮细胞CK-19的表达明显下降;血清和肺泡灌洗液中CYFRA21-1水平升高;动脉血氧饱和度呈明显下降趋势.结论 急性肺栓塞不仅导致CK-19表达降低,而且分解代谢增强,因此CYFRA21-1的检测对于判断急性肺栓塞的严重程度及预后具有重要意义.
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急性肺血栓栓塞大鼠肺组织中COMT和MAO表达降低
目的 探讨急性肺血栓栓塞大鼠的肺组织中儿茶酚胺代谢相关酶类氧甲基转移酶(COMT)和单胺氧化酶(MAO)的表达变化. 方法 建立大鼠急性肺血栓栓塞模型,分别在血栓栓塞后1、8、24和48 h采取心脏穿刺法取血,用半定量RT-PCR法和Western blot法检测COMT、MAO-A及MAO-B的mRNA和蛋白表达;用HPLC法检测血清中儿茶酚胺水平. 结果 在急性肺栓塞的不同时间点,COMT、MAO-A及MAO-B的mRNA和蛋白水平均逐渐降低,而血清中肾上腺素(EPH)和去甲肾上腺素(NE)呈逐渐升高趋势. 结论 急性肺栓塞大鼠的血清儿茶酚胺水平升高源自肺组织内的降解减少.本研究部分阐明了急性肺栓塞导致肺动脉高压的分子机制.
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大鼠急性肺血栓栓塞后血中DBP、RBP和TTR表达降低
目的 探讨急性肺血栓栓塞时维生素D结合蛋白(DBP)、维生素A结合蛋白(RBP)和甲状腺素转运蛋白(TTR)的表达变化及对代谢的影响.方法 用颈静脉插管注入血栓的方法制备大鼠急性肺栓塞模型.用Western blot检测DBP、RBP和TTR蛋白水平,RT-PCR法检测肝组织中DBP、RBP和TTR的mRNA水平,放射免疫法测定FT4和25(OH)D3的血清浓度,微量荧光法测定维生素A的血清浓度.结果 急性肺栓塞后血清中DBP、RBP和TTR的蛋白水平,肝组织中DBP、RBP和TTR的mRNA水平均逐渐降低;而血清中这3个结合蛋白的配体FT4、25(OH)D3和维生素A的水平明显升高.结论 急性肺栓塞后血清中DBP、RBP和TTR的蛋白水平降低是由于肝细胞合成减少所致,从而释放出更多的配体.升高的25(OH)D3、维生素A和FT4分子在急性肺栓塞后的一系列病理生理变化中将发挥重要作用.
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旋毛虫成虫表面抗原的SDS-PAGE和 Western blot分析
目的 研究大理猪源旋毛虫成虫表面抗原(surface antigen,SA)的蛋白组分,分析其抗原性. 方法 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对旋毛虫成虫SA蛋白成分进行分析,并采用蛋白印迹(Western blot)分析其抗原性. 结果 旋毛虫成虫SA经SDS-PAGE,电泳显示4条主要蛋白条带,分子质量单位分别为50、48、40和34 ku;经Westem blot检测,上述4个蛋白组分均能被大鼠抗旋毛虫血清识别. 结论 旋毛虫成虫sA中主要含有50、48、40和34 ku等4个蛋白组分,均具有抗原性.
关键词： 旋毛虫成虫 表面抗原 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白印迹 -
人脑胶质瘤AKT2表达与细胞增殖和侵袭性的关系
丝/苏氨酸激酶2(serine/threonine kinase β,AKT2)是近年发现的一种原癌基因,多种颅外恶性肿瘤的发生发展与AKT2的扩增、过表达和激酶活性升高有关,且肿瘤增殖和侵袭与AKT2的表达水平和激酶活性密切相关 [1].我们应用免疫组织化学和Western蛋白印迹的方法,对50例胶质瘤标本的AKT2表达进行了研究;并进一步研究了AKT2表达与Ki-67指数、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9的关系.
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诱导性低温对失血性休克大鼠肝脏PGC-1和SHP表达的影响
目的 探讨诱导性低温对失血性休克大鼠肝脏PGC-1和SHP表达的影响.方法 SD大鼠随机(随机数字法)分为:对照组、低温组和常温组.按25 ml/kg放血建立失血性休克模型,放血后分别维持大鼠直肠温度在32℃和38℃,休克60 min后回输放出的血和2倍放血量的林格液,复苏期维持60 min,复苏结束后恢复大鼠体温到38℃,监测血流动力学3h.记录建模前及建模后不同时点的血细胞压积(Hct)、乳酸(Lac)、剩余碱(BE)和血糖(Glu).采用蛋白印迹及定量PCR的方法检测复苏3h后肝组织PGC-1和SHP蛋白及mRNA表达的变化.采用SPSS 11.0软件包行计量资料的成组t检验.结果 休克模型建立后血乳酸升高(0.9±0.2)vs.(8.3±1.8)、剩余碱减少(-3.2±1.1)vs.(-7.4±3.3),与常温复苏比较,低温复苏可以显著降低血乳酸(6.3±2.1)vs.(10.4±1.5)并增加碱剩余(-4.7±2.5)vs.(-9.0±3.2).常温组动物的病死率较低温组明显增加.常温复苏可以上调PGC-1和SHP mRNA的表达(6.2±0.6)vs.(2.3±0.9),低温复苏导致PGC-1 mRNA的表达下调(-2.2±0.4),但进一步增加了SHP mRNA的表达(7.4±1.3).常温复苏3h后,PGC-1蛋白表达减少(0.39±0.13)vs.(0.24±0.12),而SHP蛋白表达增加(0.22±0.11)vs.(0.55±0.15);低温复苏后PGC-1蛋白表达进一步减少(0.39±0.13)vs.(0.18±0.11),而SHP蛋白表达增加更加明显(0.22±0.11)vs.(1.02±0.21).结论 诱导性低温可以对PGC-1和SHP基因表达进行适应性调节,进而改善酸中毒和能量代谢失衡.
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梅毒螺旋体特异性抗体检测方法的实验室评价
梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播疾病.梅毒螺旋体血细胞凝集 (TPHA)、明胶凝集(TPPA)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、荧光密螺旋体抗体吸收(FTA-ABS)、蛋白印迹试验(WB)等.特异性试验本研究细胞应用检测了252份血清样本,对临床常用的前4种检测梅毒特异性抗体的方法进行比较.
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人源M2二联体靶抗原BO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定
目的:表达二联体BO-E2重组融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期发现和临床诊断.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法扩增得到抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的二个靶抗原侧链:二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC-E2)、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2(OGDC-E2)相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a(+),构建重组表达载体pET28a(+)-BCOADC-E2,pET28a(+)-OGDC-E2,pET28a(+)-BO-E2,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot等鉴定.结果:经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了3种重组质粒.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,获得3种融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性.结论:重组表达的BO-E2融合蛋白将有利于PBC的实验室诊断.
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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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TNF-α对胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达的诱导作用
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对胃癌细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的诱导作用.方法:以外源性TNF-α作用于胃癌细胞.未经TNF-α作用的胃癌细胞作为对照.采用ELISA法检测胃癌细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9蛋白的含量.采用RT-PCR检测胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表达状况.采用Western blot检测胃癌细胞内MMP-2蛋白和MMP-9蛋白含量.结果:不同浓度(1,10和100 μg/L)的TNF-α作用胃癌细胞后,胃癌细胞上清液中MMP-2的含量分别为8.24±1.36,23.65±3.45和14.83±2.54 ng/L,均显著高于对照组(1.56±0.23 ng/L,P＜0.01);MMP-9的含量分别为12.47±2.66,34.12±6.78和23.31±4.45 ng/L,亦均明显高于对照组(5.25±0.89 ng/L,P＜0.01),其中以10μg/L TNF-α作用时升高为显著.TNF-α作用胃癌细胞16 h后,上清液中MMP-2和MMP-9含量达到峰值,分别为23.65±3.45和34.12±6.78 ng/L.胃癌细胞MMP-2 mRNA和MMP-9mRNA表达明显增强,胃癌细胞内MMP-2和MMP-9蛋白表达亦明显增多.结论:TNF-α可上调胃癌细胞MMP-2和MMP-9表达.
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前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响
目的:探讨前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响.方法:采用常规PCR法从adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBV S和前S2+S基因片段,重组到VR1012载体中,转染COS-7细胞并免疫BALB/C小鼠.采用蛋白印迹、ELISA,ELISPOT等方法检测其在COS-7细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫.结果:转染的COS-7细胞表达相应的目的蛋白,且前S2+S转染的细胞表达明显高于S转染的细胞的表达;免疫接种小鼠后2 wk产生HBSAb及HBsAg特异性CTL,前S2+S抗原免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL均强于S抗原免疫.结论:前S2抗原基因可增强乙型肝炎DNA疫苗刺激的免疫应答.
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增殖细胞核抗原在小鼠酒精性肝损伤中的表达及意义
目的:研究酒精诱导的小鼠肝损伤过程中肝脏增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达变化.方法:将100只健康清洁♂小鼠随机分为对照组(n=40)和模型组(n=60),模型组小鼠每日给予56％的红星二锅头(10 mL/kg)灌胃,对照组每日给予等体积的蒸馏水灌胃.分别于第1、2、3、4周将两组小鼠全部处死,并在各时间点取小鼠肝脏做苏木精-伊红(HE)染色并测定血清中ALT酶活力,以检测小鼠酒精性肝损伤程度.剩余肝脏通过蛋白印迹法用以检测小鼠肝脏增殖细胞核抗原的表达情况.应用SSPS16.0对实验数据进行ANOVA显著性分析和Duncan's test.结果:酒精灌胃第1周,病理HE染色显示肝细胞轻度损伤,ALT酶活力显著上升,小鼠肝脏中的PCNA的表达量相比正常小鼠显著下降(P＜0.05);第2周,病理HE染色显示肝细胞出现明显的水肿和大量的炎细胞浸润,ALT酶活力高于正常,PCNA的表达量达到了低值(P＜0.01);第3周,病理HE染色显示中央静脉周围的肝细胞脂肪变性,门管区周围肝细胞水样变,ALT酶活力下降,PCNA的表达量显著上升,但仍低于正常小鼠肝脏PCNA的表达量(P＜0.05).结论:在酒精诱导的肝损伤过程中,PCNA在小鼠肝脏中的表达先下降后上升,提示酒精诱导的肝损伤及损伤后的修复与PCNA的表达变化有关.
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乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定
目的:提取和鉴定参与乳杆菌黏附肠上皮样细胞以及粘蛋白受体的细胞壁表面蛋白.方法:采用HRP标记的粘蛋白受体以及NHS-Biotin标记的HT-29细胞与提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白进行蛋白印迹,对参与黏附的细胞壁表面蛋白进行初步鉴定.结果:Western blot结果显示Mr29000和Mr14000的两种细胞壁表面蛋白在与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性.结论:存在于乳杆菌JCM1081细胞壁表面的Mr29 000和Mr14 000的两种蛋白能够特异性识别粘蛋白受体和细胞膜受体,并与之结合,为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.
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胃肠道间质瘤组织中PDGFRα和C-kit基因突变和蛋白表达的关系
目的:检测胃肠道间质瘤(GIST)中PDGFRα和C-kit基因突变及其蛋白表达的关系及在肿瘤形成中的作用.方法:采用单链象多态性聚合酶链式反应(PCR-SSCP),免疫组化和蛋白印迹(Western blot)方法,检测GIST 52例中PDGFRα和C-kit 基因突变及蛋白表达情况.结果:GIST 52例中PDGFRα基因突变5例(9.6%),多见于梭形细胞型的胃源性GIST,C-kit基因突变28例(53.8%),多发生于小肠,并且这两种基因突变互相独立;PDGFRα蛋白表达率100%,C-kit蛋白的表达率为94.2%,突变的5例GIST PDGFRα强于C-kit突变的GIST,正常胃肠道组织和神经鞘瘤;突变与C-kit蛋白表达之间没有显著相关性(P=0.5332),而突变与PDGFRα蛋白表达之间呈显著相关性(P＜0.0001).结论:GIST中PDGFRα和C-kit突变在部分GIST肿瘤发生过程中发挥了重要作用;突变位点与起源部位和组织学类型有关;大多GIST中蛋白表达与其基因突变关系密切.
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糖基化终产物对正常人血小板内皮型一氧化氮合酶活性及其表达的影响
目的通过观察糖基化终产物(AGEs)对血小板内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性及其表达的影响,探讨AGEs损伤血小板的机制.方法健康成人6例,取外周静脉血,用凝胶色谱柱法收集纯化的血小板悬液,分别与三种浓度的AGEs(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)孵育30 min,部分血小板用同位素二步色谱法测定血小板一氧化氮合酶(NOS)活性;部分血小板用免疫沉淀法制备纯化eNOS蛋白,蛋白印迹法检测eNOS蛋白表达水平.结果 AGEs明显抑制正常人血小板NOS活性且呈浓度依赖性.正常人血小板表达eNOS;AGEs干预30 min不影响eNOS表达水平.结论AGEs通过抑制血小板eNOS活性而激活血小板,这种作用不是通过降低血小板eNOS表达实现的.
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膜联蛋白A2表达与肝纤维化和肝细胞癌的关系
目的 检测膜联蛋白A2 (ANXA2)在肝纤维化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达并探讨其临床意义.方法 采用蛋白印迹方法检测ANXA2蛋白在正常肝组织、肝硬化组织及HCC中的表达;采用免疫组织化学染色的方法检测ANXA2蛋白在HCC及癌旁肝纤维化组织中的表达,并分析其临床意义.结果 ANXA2蛋白在HCC和肝硬化中的表达较正常肝组织明显升高,又以在HCC中表达为高(P=0.000).ANXA2蛋白表达与肝纤维化分期呈显著正相关(P＜0.05).ANXA2蛋白在HCC肿瘤细胞中的表达与HBV感染、肿瘤分化程度及复发密切相关(P＜0.05).在部分HCC患者中,ANXA2蛋白在肿瘤结节外围的肿瘤细胞及周围纤维基质表达增高.结论 ANXA2蛋白过表达可能参与了肝纤维化及HCC的发生和发展.ANXA2蛋白有望成为判断肝纤维化程度、HCC肿瘤分化程度的分子标记物.
关键词： 肝细胞癌(HCC) 肝纤维化 膜联蛋白A2(ANXA2) 蛋白印迹 免疫组织化学 -
Paxillin和p130Cas蛋白在肝癌中的表达及意义
肝癌复发和转移是一个复杂的生物学过程,涉及多个基因和多种分子变化.研究表明,细胞的黏附动力学和形态改变在肿瘤的侵袭与转移中起重要作用.paxillin(桩蛋白)和p130Cas是两个黏着斑相关蛋白, 具有接头蛋白的活性,在细胞骨架与细胞外基质的黏附及细胞信号传导中起重要作用, 是很多不同癌蛋白的共同靶点[1-4].我们采用免疫组化和Western蛋白印迹的方法对原发性肝癌组织中paxillin和p130Cas蛋白表达水平进行分析,并探讨其与肝癌生物学行为的关系.
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子宫颈癌组织中RACK1蛋白的表达及其意义
子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌。以往文献报道，构架蛋白1（RACK1）在多种恶性肿瘤，如结肠癌、肺小细胞癌和黑色素瘤中表达增高[1-2]，在血管新生过程中表达也上调[1]。血管新生是实体肿瘤生长的必要条件，可提供恶性肿瘤细胞快速增殖所需要的营养，促进肿瘤生长。因此，本研究应用蛋白印迹（western blot）法和免疫组化SP法检测子宫颈癌及其癌旁组织中RACK1蛋白的表达情况，以探讨其在子宫颈癌发生、发展过程中的作用及意义。
