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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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去甲肾上腺素预处理早时相心肌细胞能量代谢变化
去甲肾上腺素(noradrenaline, NA)在心肌缺血缺氧预适应过程中的作用已经被公认[1~4],但是其具体的作用机制,尤其对细胞的能量代谢变化的分子水平研究不足,而线粒体能量代谢是一个非常重要的环节[5,6].据此,特设计此实验用微量NA对培养心肌细胞进行预处理,研究NA预处理后早时相心肌细胞在缺血缺氧损伤中线粒体跨膜电位和培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)浓度的变化,为临床治疗提供新的思考和药物选择.
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心肌线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道开放剂二氮嗪对体外大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响
近年来研究证明,心肌线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)是心肌缺血的重要治疗靶点[1].20世纪60年代二氮嗪作为抗高血压药在美国合成并上市,近来研究表明,二氮嗪是mitoKATP开放剂,具有耐缺血缺氧损伤的心脏保护作用.本研究采用体外大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察了二氮嗪对冠状动脉流量、灌流液乳酸脱氢酶(LDH)活性等的影响.
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微创外科在小儿先天性心脏病治疗中的现状与展望
随着心脏外科和相关科学技术(体外循环设备和技术、计算机信息技术和三维成像技术等)的飞速发展,心血管外科在微创思潮的推动下亦发生了深刻的技术革命.近年来,微创心脏外科(minimally invasive cardiac surgery, MICS)发展迅猛,尤其是近10年来微创外科技术不断应用于小儿先天性心脏病(先心病)的治疗中.目前,临床进行的MICS范畴至少包括以下内容:①非传统胸骨正中切口的小切口手术;②消除体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)所致损伤的非CPB技术或对血流动力学改变小的辅助循环技术;③避免心脏缺血缺氧和再灌注损伤的非停跳心脏手术;④具有微创含义,但不同于传统心脏手术方式的技术,如电视胸腔镜手术、机器人辅助外科、心导管介入治疗等,其中尤以避免或减轻CPB对机体损伤和心肌缺血缺氧损伤为微创的关键.
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肠上皮细胞缺血缺氧凋亡模型的实验研究
我们建立了以体外人工基底膜为表衬的肠上皮细胞(IEC)原代培养,模拟临床缺血缺氧损伤后IEC的脱落凋亡变化的实验模型,报道如下.
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赤芍萜苷组分抗缺血缺氧损伤的代表性成分的发现与验证
组分的发现与确证是组分制剂研究的前提.分子对接技术与药效活性评价为赤芍萜苷组分(CSTGCs)抗缺血缺氧损伤的代表性成分发现并验证提供有效方法.本研究采用UPLC-TOF/MS/MS定性分析CSTGCs的化学成分,与心肌缺血关键受体蛋白进行分子对接,并以Libdockscore筛选主要活性成分;建立H9c2细胞缺氧损伤模型,以肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为评价指标,辨识能代表CSTGCs防治心肌缺血的成分组合;进一步以细胞凋亡指数、凋亡蛋白和线粒体相关mRNA表达,验证其对缺氧细胞凋亡的抑制作用,终确定CSTGCs的代表性成分.结果显示,芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷和氧化芍药苷可与4TWT、3O4O、4KZN和1M9J等靶蛋白在空间、能量上匹配且含量较高,为CSTGCs的主要活性成分;在调节CK、LDH、SOD、MDA和维持线粒体功能、抑制细胞凋亡方面,芍药苷+芍药内酯苷+苯甲酰芍药苷组合与CSTGCs作用无统计学差异,确定为CSTGCs抗缺血缺氧损伤的代表性成分,为组分整体性质及制剂研究提供依据.
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当归挥发油对PC12细胞缺血缺氧损伤后自噬和相关信号通路的影响
目的 研究当归挥发油对PC12细胞缺血缺氧损伤后自噬和相关信号通路的影响.方法 将高分化PC12细胞分为5组:空白组、模型组和低、中、高3个剂量实验组.除空白组外,其余各组用含10 mmol·L-1连二亚硫酸钠(Na2S2O4)的无糖培养基缺氧缺糖损伤1h;同时,低、中、高3个剂量实验组加入终浓度分别为6.25,12.50,25.00μg·mL-1当归挥发油,复氧48 h.用噻唑蓝比色法检测当归挥发油对细胞增殖的影响,以免疫蛋白印迹法检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3B(LC3B-Ⅱ)、泛素结合蛋白P62(P62)]和自噬相关信号通路[磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),磷酸化动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR),磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(p-P70S6K)]蛋白的表达.结果 空白组、模型组和低、中、高3个剂量实验组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%,(56.37±4.93)%,(69.78±1.56)%,(78.35±2.01)%和(89.77±3.03)%;模型组与空白组相比或者低、中、高剂量3个实验组与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05).空白组、模型组和高剂量实验组的LC3B-Ⅱ相对表达量分别为0.30±0.04,0.56±0.05和0.42±0.03;这3组的P62的相对表达量分别为0.63±0.03,0.17±0.01和0.40±0.01;模型组与空白组相比或者高剂量实验组与模型组相比,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05,P<0.01).同时,p-Akt、p-mTOR与p-P70S6K的表达趋势与LC3B-Ⅱ的结果一致.结论 当归挥发油可能通过激活Akt/mTOR信号转导通路抑制缺血缺氧损伤引起的PC12细胞自噬,保护受损细胞.
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二氮嗪对谷氨酸所致PC12细胞损伤的保护作用
近来研究表明,二氮嗪是一种选择性线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂,它不仅是血管扩张剂,还是耐缺血缺氧损伤的心脏保护药物.本研究的目的旨在从体外培养的PC12细胞水平初步探讨二氮嗪的神经保护作用.
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依达拉奉对海马神经元缺血缺氧损伤后线粒体膜电位的影响
目的 探讨缺血缺氧损伤后依达拉奉对海马神经元线粒体膜电位的影响.方法 原代培养海马神经元细胞,建立缺血缺氧损伤模型,分为正常细胞组、缺血缺氧组、依达拉奉干预组(分别给予1、10、100、300 μmol/L依达拉奉干预)和阳性参照药维生素C干预组,将各组海马神经元细胞用线粒体膜电位敏感性染料Rhodamine-123 进行染色后,激光共聚焦显微镜分别检测线粒体膜电位.结果 与缺血缺氧损伤组比,加入100 μmol/L和300 μmol/L依达拉奉可以显著提高损伤海马神经元的线粒体膜电位,达到正常神经元线粒体膜电位的82%和87%.100 μmol/L和300 μmol/L依达拉奉组之间对线粒体膜电位的的稳定作用没有统计学差异(P>0.05).结论 缺血缺氧损伤后海马神经元线粒体膜电位下降,依达拉奉能够促进线粒体膜电位的恢复,起到神经保护作用.
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热休克蛋白70表达与心肌细胞缺氧性凋亡的关系
心肌缺血、缺氧在临床非常常见.缺氧极易导致心肌细胞损伤,甚至死亡.细胞凋亡是心肌细胞的另一种死亡途径[1].热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP 70)是一种重要的应激蛋白,是心肌细胞耐受缺血缺氧损伤的内源性物质.本实验旨在探讨缺氧时培养心肌细胞HSP 70的表达及其与凋亡发生的关系,为心肌保护的深入研究提供理论依据.
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中风(脑中风)
什么是中风? 中风亦称脑中风,指脑血管栓塞或破裂所致脑血流中断、脑组织缺血缺氧损伤,从而引起患者各种症状和体征,例如口角下垂、麻木和面瘫.
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L-NMMA和L-Arg对体外培养海马神经元缺血缺氧损伤调控作用及其机制的研究
近年来研究发现一氧化氮(NO)在缺血缺氧机制中具有重要作用.NO与细胞凋亡的关系仍存在着较大分歧,实验证明NO既可诱导凋亡又可抑制凋亡.本研究利用体外培养海马神经元,通过去除培养液中糖和氧气模拟缺血缺氧状态,以细胞形态学、细胞存活率、乳酸脱氢酶变化描述细胞损伤程度,观察NO合成前体物左旋精氨酸(L-Arg)、NO合成酶(NOS)抑制剂N单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)对缺血缺氧损伤体外培养海马神经元的影响,并初步探讨了两者与细胞凋亡的关系.
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缺氧预处理在心肌保护中的作用机制
缺血性心脏病是严重危害人类健康的常见病,其发病机理和防治方法的研究是医学界关注的焦点.对于心肌保护作用研究始于70年代以前,主要侧重于调节心肌血氧的供需平衡,降低心肌的负荷,增加冠状动脉血流以及如何促进侧枝循环的建立.1986年Masolv等[1]首次提出心肌在经受了多次短暂的缺血-再灌注(ischemic reperfusion,I-R)后,能在随后的长时间缺血中延迟并减轻心肌细胞损伤.此后对发病机理的认识上升到细胞分子水平,心肌保护的重点也转移到细胞保护层面,即增强心肌细胞对缺血缺氧损伤的抵抗力,防止细胞损伤向不可逆性方向的发展,从而提高细胞存活率.目前内源性抗损伤被认为是可能有效的保护措施,涉及细胞保护机理的研究.
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清瘀方对血管内皮细胞缺血缺氧损伤的保护作用
目的 观察清瘀方对血管内皮细胞缺血缺氧损伤的影响.方法 应用H_2O_2及Na_2S_2O_4造成的人静脉血管内皮细胞(HUVECs)缺血缺氧模型,通过MTT染色和细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的检测,观察清瘀方含药血清对造模细胞的保护作用.结果 较大剂量清瘀方含药血清能明显减少LDH的漏出,抑制H_2O_2及Na_2S_2O_4造成的内皮细胞损伤.结论 清瘀方对缺血缺氧引起血管内皮细胞具有保护作用.
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激光共聚焦显微镜技术在研究肠上皮细胞内钙超载中的应用
细胞内钙稳态的维持对生命活动至关重要.病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,致细胞坏死和凋亡[1,2].目前有关肠上皮细胞(IEC)缺血缺氧损伤导致IEC细胞内钙超载是否确切,钙离子阻断剂是否有防治作用,目前尚无这方面的研究报道.激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)可定量分析活细胞内不同部位的[Ca2+]i及其动态变化,还可提供高分辨率的钙离子动态变化图像,是记录钙荧光信号的有效技术手段[3].我们采用LSCM技术,用钙敏荧光探针Fluo-3/AM标记培养的IEC,实时动态观察在缺血缺氧损伤及加用钙离子阻断剂后细胞内钙超载的影响.
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肽能生长因子在缺血缺氧性脑损伤中的应用
缺血缺氧性脑病是与围产期窒息密切相关的一种具严重后遗症的新生儿期疾病, 它引起的脑瘫和智能落后影响了患儿终生的生存质量, 尽管对其发病机制已逐渐明了, 然而临床干预仍十分棘手.近年来国外学者研究发现, 一些肽能生长因子: 如神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、血小板源生长因子(PDGF)和肝素结合性表皮因子(HB-EGF)等都与缺血缺氧性脑损伤呈现一定的相关性, 因此了解这些因子在缺血缺氧损伤中的表达及神经营养作用, 有利于探讨其在缺血缺氧性脑病中的治疗前景.
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严重烧伤后肠道屏障功能障碍与防治
以往人们对肠道功能的认识仅局限于他是一个消化器官,偏重于营养物质的消化和吸收,在烧(创)伤、休克、感染等所致危重病人的抢救中,临床医生治疗的侧重点主要集中在心、肺、肾等重要脏器上,疏忽了肠道屏障功能在危重症发生、发展中作用.20世纪80年代以后,随着临床营养学和危重医学的发展,在肠道屏障功能方面做了大量研究,发现消化道是人体内大的细菌和内毒素库,在正常情况下肠道屏障功能使细菌和内毒素局限在肠道内.新观点认为肠道不仅是吸收营养素的器官,也是阻止肠腔内细菌、毒素等有害物质侵入体内的重要屏障,以及调控机体应激反应、生成炎症介质的重要器官,在严重创伤、烧伤、大手术、休克等应激状态下,肠黏膜发生缺血缺氧损伤、肠内菌群失调、免疫功能异常,使肠道屏障发生破坏,促使肠道菌群易位和内毒素吸收,导致全身炎性反应综合征(SIRS)、全身感染和多器官功能功能障碍综合征(MODS)发生等.
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虎杖甙对缺血缺氧平滑肌细胞PKC活性的影响
目的:通过观察虎杖甙(PD)对缺血缺氧(模拟失血性休克)平滑肌细胞内蛋白激酶C 活性的影响,探讨虎杖甙抗休克和调节血管平滑肌细胞收缩性的机制.方法:取培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,用DE-52纤维素层析方法初步提纯PKC,用组蛋白ⅢS作为底物,用同位素闪烁计数的方法测量其活性.实验分组如下:对照组(不加任何刺激),单纯PD组(加PD作用2 h, PD终浓度为0.4 mmol/L),缺氧组(按Koyama法复制缺血缺氧模型,平滑肌细胞置于无氧无血清无糖环境培养4 h后收集细胞,不做其它处理),PD治疗组(缺氧组基础上加PD治疗2 h ,PD终浓度为0.4 mmol/L),治疗对照组(缺氧组基础上加等量D-Hanks作用2 h). 结果:对照组平滑肌细胞胞浆PKC活性为(11.08±3.13) fmol*mg-1*min -1,单纯PD处理可使平滑肌细胞胞浆 PKC活性增加,达到(30.02±4.16) fmol*mg-1*min-1,和对照组相比有显著差异(P<0.05).缺氧损伤后胞浆PKC活性也显著上升为(21.62±3.57) fmol*mg-1*min-1 ( P<0.05),而经PD治疗后胞浆PKC活性下降为(11.52±2.33) fmol*mg-1*min-1,和未治疗时相比有显著差异(P<0.05). 而治疗对照组为(21.39±3.54) fmol*mg-1*min-1,和缺氧组结果相似. 对于胞膜部分的PKC活性 ,结果则略有不同.对照组胞膜PKC活性为(9.49±0.97) fmol*mg-1*min-1 ,单纯PD作用后其活性上升为(17.22±2.07) fmol*mg-1*min-1,缺氧后胞膜PKC的活性下降为(4.74±1.42) fmol*mg-1*min-1,经PD治疗后脑膜活性有所恢复,上升为(9.43±2.02) fmol*mg-1*min-1.讨论:缺氧引起平滑肌细胞胞膜和胞浆PKC活性的改变,缺血缺氧损伤后,细胞浆的PKC活性上升,胞膜部分 PKC活性下降.表明PKC可能介导缺血缺氧引起的损害效应,其损伤机理可能与缺氧引起PKC 激活后转位障碍有关.在体动物实验表明PD可使休克动物收缩的细动脉和细静脉口径增大、增大脉压差、改善微循环灌流,对休克有显著疗效.本实验发现PD对PKC的影响呈现出双相调节特征.对正常的平滑肌细胞使其PKC活性升高,而对缺氧损伤组则使其胞浆升高的PKC活性降低,使降低的胞膜PKC活性升高.缺血缺氧后可能直接激活了胞膜上磷脂酶C等,产生IP 3和DAG,DAG再激活胞浆PKC,PKC的活化引起小血管的收缩,导致休克后的微循环障碍.近来认为,缺血缺氧导致机体产生大量的自由基和脂质氧化物,这些物质可使PKC的激动剂DAG 不易被代谢分解,从而使PKC的活性持续升高,因而加重了机体的损伤.实验中PD可以降低缺血缺氧损伤后升高的胞浆PKC活性,并纠正PKC转位障碍,提示PD的抗休克作用可能与PKC 信号通路有关.由于平滑肌细胞中PKC的激活可使平滑肌细胞内钙调蛋白、肌球蛋白轻链以及胞膜上钙离子通道等发生磷酸化,引起平滑肌收缩和血管张力改变,因此,PD对PKC活性的双相调节作用可能也是其改善微循环的作用机制之一. 结论:本实验结果提示PKC可能介导缺血缺氧引起的损害效应,其损伤机理可能与缺血缺氧引起PKC激活后转位障碍有关.PD对平滑肌细胞PKC活性起双相调节作用,这可能是PD改善微循环和抗体克的作用机制之一.
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木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对缺血缺氧培养乳鼠心肌细胞的保护作用
目的 观察木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对缺血缺氧培养乳鼠心肌细胞的保护作用及其可能机制.方法 采用原代培养的乳鼠心肌细胞造成缺血缺氧损伤模型,观察木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对损伤后心肌细胞存活率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影响,推断细胞内活性氧的生成量;观察培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,以判断细胞损伤情况;并进行hochest33258 染色,判断细胞凋亡程度.结果 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(100,50 μg/mL)组可显著升高缺血缺氧损伤时细胞存活率、提高细胞SOD活性,降低MDA含量、降低LDH的漏出量,细胞凋亡率降低.结论 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对缺血缺氧培养的心肌细胞具有保护作用,其机制可能与清除氧自由基,稳定细胞膜,抑制细胞凋亡有关.
关键词: 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 心肌细胞 缺血缺氧损伤 氧自由基 凋亡 -
心脏不停跳心内直视术的监测及护理进展
自1973年Gay成功应用冷钾停跳液以来,传统的低温便成了心肌保护的重要措施[1].国内外专家对心停跳液的成分、浓度、温度、pH值、加入各种中西药物、灌注、流量、压力和剂量等进行了深入的研究,取得了很大的进展,但是都局限在心脏停跳、心肌经受不同程度的缺血缺氧损伤和再灌注损伤的领域里[2].