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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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2010年ADA糖尿病诊疗指南
V.糖尿病治疗A.初始评价一项完整的糖尿病医疗评价包括对糖尿病进行分类、检测目前糖尿病并发症、对已确诊糖尿病患者以往治疗和血糖控制的回顾、帮助制定管理计划以及为持续治疗提供基础.而适用于评价每一位患者医治情况的实验室检查都应实施.关注糖尿病患者整体治疗的相关因素有助于保证健康管理团队为患者提供佳治疗管理.
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浅谈检验科设备管理的问题及对策
检验科设备的管理是设备自身运动的客观要求.目的在于及时发现和处理设备运行过程中,因技术状态变化而引起的大量、常见问题,改善设备的使用状态,保证设备的正常运转,延长设备的使用寿命,完成各种检查项目的检测目的.
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不同真空采血管对胶体金法检测D-二聚体结果的影响
血浆D-二聚体检测目前已被广泛应用于临床[1,2],在弥散性血管内凝血(DIC)、肺血栓栓塞、恶性肿瘤、肝硬化、妊娠高血压综合征等疾病的诊断、鉴别诊断、病情监测及预后的判断以及抗凝治疗的监测中发挥了重要作用[3-5]。准确测定D-二聚体,避免临床误诊误判显得尤为重要。现在医院检验科自动化程度越来越高,操作也日趋规范,有资料显示检验结果差错70%来自检验前,因此重视检验前质量控制是当前检验人员面临的又一难题。本研究从标本来源对D-二聚体检测结果的影响进行分析,现报告如下。
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原位杂交技术的应用及操作体会
原位杂交技术的原理是依据核酸碱基互补配对原则,利用标记的特定序列探针与待测样本中的原位检测目的基因互补核酸序列杂交,经信号放大显色后镜下观察结果.该方法具有2 个特点:①基因水平的检测,即直接检测DNA 或RNA ;②可以明确定位,在保存组织结构同时揭示组织细胞的异质性,细胞基因表达的异质性和细胞器中的区别定位[1].现根据我科目前开展的DNA 原位杂交人乳头状病毒(HPV)的检测,在日常操作中的方法及体会介绍如下.
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导数光谱谱线组判别分析法鉴别椰毒假单胞菌
椰毒假单胞菌是我国发现的一种新的食物中毒菌,对椰毒假单胞菌的检测目前尚无简便、快速的鉴别方法.本文以对此菌的快速鉴别为例,提出"导数光谱谱线组判别分析法"鉴定微生物的新的光谱鉴定方法.
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转基因技术常用的检测方法
将外源基因通过一定载体转入靶细胞内的技术称为转基因技术(Gene transfer or Gene transform).近十余年来,人们广泛利用分子生物学技术对原核细胞和真核细胞进行转基因工作,旨在进一步解释人类疾病的发病机制,探讨疾病诊断和治疗的新途径.转基因技术一般包括①目的基因获得;②将目的基因导入靶细胞内;③检测目的基因在靶细胞内表达水平三个重要环节[1].因此,如何判断外源基因是否导入靶细胞内,靶细胞的表达产物是否具有生物效应是转基因技术的重要一环.本文仅就目前常用的有关转基因技术的检测方法进行综述.
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表达EGFP的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响
在基因功能研究过程中,常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达(transient expression),以流式细胞仪检测细胞周期的变化,观察转基因对细胞增殖的影响.由于各种转基因方法的不同,转基因的效率也不同,往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因,没有转基因的细胞将影响检测的结果.如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测,是一个技术上的难点.一种直接的方法是采用目的基因表达蛋白的抗体直接标记表达目的基因的细胞,条件是该目的基因必须是细胞内特异的,且表达的蛋白位于细胞膜.另外一种方法就是采用双基因共转染方法,常用的共转染基因有B或T淋巴细胞的分化抗原,如:CD19、CD20等[1].
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胶体金法与分离法检测霍乱弧菌结果比较
霍乱弧菌的检测目前以培养法为标准,该法可用于各种临床标本,而近几年发展起来的胶体金免疫快速检测法,是利用单克隆抗体胶体金标记技术和膜层析技术研制而成,用于定性检测标本中可能存在的霍乱弧菌群菌体抗原.
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免疫组化和蛋白质印迹中抗原-抗体反应方法的改进
免疫组化和蛋白质印迹(Western blotting)是生物医学科研和教学中鉴定目的蛋白表达的常用手段.二者的原理基本一致,即通过抗原与抗体的特异性免疫反应来检测目的蛋白质.由于抗体的价格昂贵,因此免疫反应的效率是决定实验成本的至关因素.传统的方法是将抗体滴加到贴于载玻片的标本上(免疫组化)[1]或将蛋白印迹膜置于含有抗体的塑料袋中进行免疫反应[2].这些方法往往消耗大量的抗体,且操作复杂.本实验室经过反复试验,建立了一种能大大降低成本的"倒覆"反应法,现报告如下.
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ECL和RIA法检测血清CEA和β-HCG的比较
近年来,非放射标记免疫分析技术的自动化应用取得许多新的进展,并广泛应用于临床,其中电化学发光免疫分析(ECLIA)技术,以灵敏度高、检测范围广、速度快而备受青睐,而传统的放射免疫分析(RIA)面临自动化技术的挑战,不断完善其测量体系,以独有的灵敏度和价廉等优势,仍占有一定的市场.为探讨两种检测方法之间的差别,我们选择了癌胚抗原(CEA)和β绒毛膜促性腺激素(β-HCG)作为检测目的,分别采用电化学发光和RIA法进行检测,尝试对两种方法进行比较,旨在为实验室及临床提供有关信息.
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介绍一种原位PCR检测方法
原位PCR就是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合,在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列[1].作者介绍一种原位PCR方法是利用卵白素与生物素间的极高亲和力,通过一段外源性DNA片段,来达到连接标记NTPs的目的,再通过原位杂交技术来检测目的DNA.具体方法如下.
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不同方法测定孕妇标本纤维蛋白原结果的分析
纤维蛋白原(FIB)定量检测目前常用的方法有根据凝血酶原时间(PT)推算FIB含量的PT衍生法(PT-der法)和冯·克劳斯法(Clauss法)。PT-derik快速经济,但易受标本的浊度影响;而Clauss法属功能法,是美国国家临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的方法,结果较可靠,但由于Fib的异质性,纤维蛋白(原)降解产物(FDP),D-二聚体(D-D)及存在肝素等抗凝物时会影响其测定,使其结果偏低。妊娠妇女常处于……
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体检如何『个性化』
腹部肥胖者加做体脂肪率检测目前35~45岁人群中"隐形肥胖"的比例非常高,大约超过40%.这些人群的体重指数都没有超标,但身体脂肪的比例已超过正常,肌肉含量低,早现出"中心性肥胖"的特征,虽然这种隐性肥胖可能暂时没有造成不良的身体症状.但如果持续发展,就容易导致脂肪肝、高血脂等一系列疾病的发生.因此,建议增加体脂肪率检测.
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解读临床肝功能检验结果
肝功能检查是通过各种生化试验方法检测与肝脏功能代谢有关的各项指标,以反映肝脏的功能基本状况.肝脏被喻为人体内的"中心实验室".由于肝脏功能多样,所以肝功能检查方法很多.虽然同时检测多种肝功能试验,在理论上有助于更好地评价肝功能状态,但在临床实际中不可能也没有必要同时检测过多的试验.熟悉每项肝功能的意义,根据检测目的,选择必要的项目,更能对临床病人的肝功能状态做出正确、客观的评价[1].根据目前临床使用的肝功能实验项目大致可分六类:
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氢化物一原子荧光法测定中药中的砷
各种食品、饮用水、中药材及其制剂中有害元素砷是必检的卫生指标.对中药材及其制剂中砷检测目前尚无国家标准.该法以湿法消化样品.检测中以硼氢化钠为还原剂,使样品中的砷生成氢化砷.用载气载入石英原子化器,加热分解为原子态砷.在特制砷空心阴极灯照射下基态砷原子被激发至高能态,发射出特征波长的荧光,其荧光强度在一定浓度范围内与砷含量成正比,与标准系列比较定量,检测中药中的砷.
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血清GPDA在儿童及青少年中的检测结果
甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA),能特异性地水解N-末端第二位为脯氨酰的肽键.GPDA在人体分布广泛,血清GPDA的检测目前主要用于肝脏病变,尤其肝癌的鉴别诊断及胃癌的辅助诊断.对于GPDA的生理作用目前尚无确定的解释,但已发现不少现象提示其生理作用可能与胶原肽的降解的关.作者测定了73例健康儿童及青少年的血清GPDA及ALP,现报道如下:
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探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素
食品中大肠菌群的检测目前普遍采用九管发酵法,但该法操作繁琐,所需时间长(1个阳性结果需72h),不能满足快速高效的现代食品生产对卫生质量控制的要求.纸片法是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体来测定食品中微生物的方法,其特点为不易在琼脂、液体培养基上观察到的现象可以在纸片上看到,并能使常规方法中分阶段培养的过程在纸片上同时完成,因此纸片法的大优点就是可以缩短检测时间.在前人研究的基础上,本文系统的对纸片法的各种影响因素和条件进行了研究,旨在为建立大肠菌群的纸片法提供可靠依据.