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结核杆菌Rv0901基因真核表达质粒的构建及在细胞内的表达与鉴定
目的 构建结核杆菌Rv0901基因的真核表达质粒并进行表达,为研究Rv0901基因的功能提供材料.方法 以结核杆菌基因组DNA为模板PCR扩增Rv0901基因序列,将Rv0901基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)获得重组表达质粒,体外转染Cos7细胞,RT-PCR检测转染的情况,并提取转染细胞总蛋白和收集细胞培养液上清检测蛋白的表达,Western-blotting检测蛋白表达的特异性.结果 成功扩增出Rv0901基因序列,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Rv0901,重组质粒转染细胞后的RT-PCR能扩增出Rv0901基因序列,转染细胞总蛋白和细胞培养液上清均能特异表达Rv0901基因蛋白.结论 成功构建Rv0901基因真核表达质粒并在真核细胞内进行了良好表达,为研究该基因功能打下了坚实基础.
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绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究
本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率,同时观察绿色荧光蛋白(GFP)作为报告系统用于转染条件优化的可行性.目的基因以GFP为报告系统,通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞,荧光显微镜下观察并计算转染效率.结果表明:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,电穿孔转染效率在10%左右,而脂质体转染效率小于1%.结论:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件.
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脂质体转染反义脱氧寡核苷酸对K562细胞α珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响
本研究查明脂质体转染反义脱氧寡核苷酸(ASON)对K562细胞α珠蛋白基因表达的抑制作用及对细胞增殖的影响,探讨基因调控治疗β地中海贫血的新思路.设计合成靶向α珠蛋白基因的ASON,并与正义寡核苷酸(SON)和空白对照进行比较.采用脂质体转染技术将ASON、SON与K562细胞共同培养,用荧光显微术、流式细胞术检测脂质体转染效率,用实时荧光定量RT-PCR法检测K562细胞中α珠蛋白基因表达情况,并通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法观察脂质体转染ASON技术对细胞增殖的影响.结果表明:脂质体转染效率在ASON作用24h达到高,脂质体转染ASON组的α珠蛋白基因表达水平显著低于SON和空白对照组(p＜0.01),并对细胞的增殖有明显的抑制作用,上述效应呈浓度依赖性.结论:脂质体转染ASON能特异性的抑制K562细胞中α珠蛋白基因表达,可能会成为β地中海贫血基因治疗的一个新靶点.
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抑制p53缺失和突变型白血病细胞PPP2R5A表达后细胞生物学变化
目的 探讨在p53缺失和突变型白血病细胞内PPP2R5A表达量的下降与细胞生物学变化之间的关系,为寻找核干细胞因子(NS)的非p53依赖性信号转导通路提供依据.方法 利用脂质体转染技术将针对PPP2R5A的siRNA转染到p53缺失或突变型的白血病细胞HL-60、THP-1和Raji细胞内,沉默PPP2R5A基因.RT-PCR法和免疫细胞化学法检测siRNA的转染效果并找出佳转染浓度和时间.倒置显微镜观察转染组和对照组细胞的生长状态并绘制细胞生长曲线.瑞-吉染色观察转染组和对照组细胞的胞核、染色质及形态改变.流式细胞术Annexin V/PI双染法进行细胞凋亡分析,PI DNA染色法进行细胞周期测定.结果 倒置显微镜观察显示转染后细胞生长状态和形态均出现变化,瑞-吉染色显示转染后细胞有凋亡小体形成.细胞凋亡分析和细胞周期测定显示转染组凋亡细胞百分比率增高,G1期和G2/M期细胞百分比上升,而S期细胞百分比减低,表明细胞增殖减弱.结论 抑制p53缺失或突变型白血病细胞PPP2R5A基因后细胞的凋亡、分化有一定变化,提示p53缺失或突变型白血病细胞中PPP2R5A在细胞分化、凋亡调控中扮演一定角色,为验证NS非p53途径的信号通路是否与PPP2R5A有关提供了依据.
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短发夹状RNA真核表达载体对HL-60细胞生存素基因表达的影响及诱导凋亡作用
近研究发现,白血病细胞凋亡受阻与生存素(survivin)的过度表达有关.为此,我们设计了survivin特异性短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,利用脂质体转染急性粒细胞白血病细胞株HL-60细胞,检测转染前后细胞survivin基因mRNA和蛋白表达以及凋亡情况,探讨以survivin为靶点,将RNA干扰(RNA interference,RNAi)用于白血病基因治疗的可行性.
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人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体
目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中.在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见乙型肝炎病毒S基因和核心基因表达.转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量.结论:人为截断HCV 5'NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础.
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鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
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乙型肝炎病毒DNA聚合酶N末端蛋白基因芯片研究
目的:检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶N末端蛋白(TP)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明TP在乙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据AF384372 HBVDNA病毒株序列设计、合成HBV DNA P-TP基因序列特异性的引物,以含有AF384372HBVDNA P全基因组cDNA的质粒G318A7作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HBV DNA-TP编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TP.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有TP蛋白的表达,提取高质量的mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有111个基因表达水平显著上调,88个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV DNA P-TP转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明TP蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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反义Survivin诱导食管鳞癌细胞凋亡
目的:研究Survivin ASODN联合三氧化二砷(As2O3)对食管鳞癌细胞系EC109凋亡的影响.方法:设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸(ASODN).细胞分成6组:空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240 nmol/L反义链转染组.以阳离子脂质体为载体转染至EC109细胞内,用Western blot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况;TUNEL法检测细胞凋亡情况;MTT法检测As2O3和5-氟尿嘧啶(5-Fu)对转染前后细胞的生长抑制情况.结果:各浓度ASODN转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少,而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化.各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(5.48±1.56,6.04±1.95,11.92±1.76 vs 1.52±0.73,P＜0.05),以240 nmol/L转染组明显高于160和200 nmol/L组(11.92±1.76%vs5.48±1.56%,6.04±1.95%,P＜0.05).240 nmol/L转染组中As2O3对肿瘤细胞生长抑制率明显高于5-Fu组(56.40±1.27%vs 43.49±0.83%,P＜0.05).结论:Survivin ASODN转染食管鳞癌细胞能下调Survivin蛋白的表达,诱导食管鳞癌细胞凋亡,抑制细胞增值,增加食管鳞癌细胞对化疗药物As2O3的敏感性.
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筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致肝细胞癌发生发展过程中的分子生物学机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCV NS4B基因序列特异性的引物,以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCV NS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCV NS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.
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辛伐他汀通过磷酸化作用增强内皮一氧化氮合酶活性
目的 建立含人内皮一氧化氮合酶(eNOS)基因的人胎肾细胞株,研究他汀类药物对eNOS活性的影响.方法 用脂质体转染的方法将含有eNOS基因的质粒pcDNA3.l-eNOS导入人胎肾细胞(293细胞),利用G418筛选二次,以免疫印迹法鉴定并筛选出稳定表达eNOS的阳性克隆.将辛伐他汀(10 μmol/L)加入eNOS阳性细胞系培养2h后,收获细胞并用同位素二步色谱法检测eNOS的活性,同时用Western Blot蛋白检测eNOS、磷酸化的eNOS表达水平和细胞内信号分子Akt、AMPK水平以探讨辛伐他汀调节eNOS活性的机制.结果 Western Blot显示经转染pcDNA3.l-eNOS并筛选后的后的293细胞20%的克隆能稳定有效表达eNOS蛋白;辛伐他汀处理2 h后eNOS活性明显升高(P＜0.05).结论 成功建立了具有G418抗性的含pcDNA3.l-eNOS基因的人胎肾细胞株,并且证明辛伐他汀可通过调节eNOS的活性来调节NO的生成,这可能为心血管疾病的治疗提高一种新的思路.
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新生鼠心脏成纤维细胞原代培养及脂质体转染条件优化的实验研究
目的：探讨新生大鼠心脏成纤维细胞（CFs）的原代培养方法及脂质体转染条件的优化。
方法：酶消化法原代培养CFs，倒置显微镜下观察细胞生长状态，免疫细胞化学染色鉴定CFs，并采用脂质体转染原代CFs，流式细胞术检测转染率。 -
HBx基因稳定转染对SUDHL-4细胞增殖和转移影响
目的 临床上发现许多恶性淋巴瘤患者伴有乙型肝炎病毒的感染,两者的关系日益受到关注.本研究旨在研究HBx基因稳定转柒对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖和转移的影响.方法 利用脂质体转染法将pcDNA3.1-x转入SUDHL-4细胞中,经G418筛选出稳定表达HBx的细胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作对照,采用细胞计数盒8(cell counting kit 8,CCK8)法检测各组细胞24、48、72和96 h的增殖活性;利用流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期和凋亡变化情况;采用改良四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞黏附力;用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭力.结果 将HBx转入SUDHL-4细胞中,经筛选的SUDHL-4-HBx细胞有HBx mRNA及蛋白质的表达.细胞增殖实验结果显示,稳定构建的SUDHL-4-HBx细胞株24、48、72和96 h吸光度(A)值分别为0.36±0.011、0.76±0.009、1.55±0.042和1.58±0.057,对照组SUDHL-4细胞24、48、72和96 h的A值分别为0.29±0.003、0.46±0.126、0.84±0.026和0.90±0.015,SUDHL-4-con细胞24、48、72和96 h的A值分别为0.22±0.001、0.38±0.008、0.83±0.035和1.01±0.054.稳定构建的SUDHL-4-HBx细胞株相比于对照组SUDHL-4细胞和SUDHL-4-con细胞48 h后增殖显著加快,HBx与时间之间存在协同的交互作用,P＜0.05.细胞周期无明显变化.SUDHL-4、SUDHL-4-con和SUDHL-4-HBx组细胞的凋亡率分别为(14.9±0.18)％、(i0.1±0.31)％和(4.8±0.26)％,SUDHL-4-HBx组细胞凋亡明显减少,与其他两组比较差异有统计学意义,P＜0.05.改良MTT法测得SUDHL-4组、SUDHL-4-con组和SUDHL-4-HBx组细胞的黏附力分别为0.70±0.14、0.63±0.21和1.23±0.43,与其他两组相比,SUDHL-4-HBx组细胞的黏附力显著增加,P＜0.05.Transwell小室实验结果显示,SUDHL-4和SUDHL-4-con组迁移细胞数分别为(58±4)个/400倍视野和(56±5)个/400倍视野,SUDHL-4-HBx组迁移细胞数为(73±5)个/400倍视野,与对照组相比显著增加,P＜0.05;SUDHL-4、SUDHL-4-con和SUDHL-4-HBx组侵袭细胞数分别为(64±5)个/400倍视野、(63±6)个/400倍视野和(81±5)个/400倍视野,SUDHL-4-HBx组细胞侵袭能力显著增加,P＜0.05.结论 成功构建稳定转染HBx的淋巴瘤细胞SUDHL-4-HBx,HBx的稳定表达可抑制人淋巴瘤细胞SUDHL-4的凋亡,促进细胞增殖,提高细胞的黏附、迁移、侵袭能力.
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脂质体转基因应用的研究进展
脂质体(liposome)特别是阳离子脂质体(cationic liposome)作为一种基因转运工具得到了广泛的应用。与其它非病毒基因转运系统一样，它具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点［1］。脂质体介导的转染技术已被广泛应用于将外源性基因导入哺乳动物细胞的研究中。本文就近年来脂质体在真核细胞和真核生物中转基因应用的研究进展做一回顾。 一、在治疗肿瘤方面的应用：脂质体作为一种转基因的载体，被人们纷纷应用于通过转移不同的外源基因来达到治疗各种肿瘤的目的。Meye等［2］用阳离子脂质体将表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的外源基因转入自行建立的两种肉瘤细胞株(L MS6-93，US8-93)中，转染后24小时，高达37%的细胞表达GFP，24～48小时转染效率高，72小时后GFP表达下降。该实验表明，对于粘附生长的肿瘤细胞用脂质体转染是一种有效的转基因手段。Kurane等［3］针对腺癌设计了一种高度特异的转基因方法：他们用抗Lewis Y抗原(Lewis Ya ntigen,LYA)的单克隆抗体与含有嵌合的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)启动子的质粒和阳离子脂质体的复合物，转染能产生CEA且LYA阳性的腺癌细胞株，结果获得的转基因表达比不产生CEA且LYA阴性的腺癌细胞株高200倍。更有意义的是，Li等［4］发现即便不用脂质体转运外源基因而单独用脂质体处理细胞后，即可明显诱导内源性干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)产生干扰素。脂质体在宿主细胞内诱导干扰素合成的这种能力，对肿瘤性疾病的基因治疗是非常有用的。
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滋补脾阴方药对大鼠树突棘保护作用的机制
目的 探讨滋补脾阴方药的神经保护作用与树突棘形态调节之间的相关分子机制.方法 荧光显微镜和免疫荧光细胞化学方法观察滋补脾阴方药含药血清预处理与谷氨酸处理前后大鼠树突棘的形态结构变化及树突棘内树突棘相关的Rap特异性GTPase活化蛋白(SPAR)、血清诱导激酶(SNK)的表达变化情况.结果 2%浓度的滋补脾阴方药含药血清预处理对于谷氨酸引起的原代海马神经元树突棘的损伤有明显的保护作用.结论 滋补脾阴方药的神经保护作用与维持树突棘正常的形态和结构有关.
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重组干扰质粒对多药抗性Acc-3细胞Bcl-2基因表达作用实验研究
目的 探讨重组干扰质粒对口腔腺样囊性癌多药抗性细胞株(Acc-3/CDDP)细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率.方法 按siRNA设计原则设计针对Bcl-2基因的Oligo DNA,体外化学合成Oligo DNA,Oligo DNA退火、连接、转化、筛选克隆,构建针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒(psiB1、psiB2、psiB3),细胞脂质体转染多药抗性Acc-3/CDDP细胞,Realtime RT-PCR的标准曲线、扩增曲线和熔解曲线的数据收集处理,采用荧光定量RT-PCR方法检测重组干扰质粒对多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因表达的干扰效率.结果 实时荧光定量RT-PCR方法检测psiB1、psiB2、psiB3质粒脂质体转染后Bcl-2基因的表达情况结果显示:psiB1、psiB3相对于对照组无明显干扰效果,psiB2的干扰程度达66.20%.结论 针对Bcl-2基因的表达重组RNA干扰质粒psiB2(CCgggAgATAgTgATgAA)能有效沉默多药抗性Acc-3/CDDP细胞中Bcl-2基因的表达.
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一种高效转染西藏小型猪胚胎成纤维细胞的方法
目的：应用Nucleofector II核转染仪将外源基因EGFP导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞（PEFs），并与脂质体转染的方法进行比较，寻求一种高效转染猪胚胎成纤维细胞的方法。方法使用 Lonza 公司的Nucleofector II核转染仪，参考已报道的转染程序与相应的转染试剂，将绿色荧光蛋白（ GFP）基因导入西藏小型猪PEFs，并与脂质体转染的方法进行对比研究，比较两种方法的转染效率。结果转染5 h后，核转染仪组镜下即可见绿色荧光，转染效率高达80％，远远高于脂质体转染的方法。结论用Nucleofector II核转染仪能实现西藏小型猪PEFs的高效转染，为高效制备转基因克隆西藏小型猪提供了可靠的方法。
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腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究
目的:利用腺病毒载体和脂质体转染脐静脉内皮细胞探讨转染脐静脉内皮细胞的理想条件.方法:分别使用腺病毒载体和Lipofectamine 2000脂质体介导VEGF165基因转染脐静脉内皮细胞.转染后通过倒置荧光显微镜检测转染效率,对比探讨转染脐静脉内皮细胞的理想方法.结果:采用脂质体法转染脐静脉内皮细胞效果不理想,转染率约11.60%.采用腺病毒载体转染率明显高于脂质体法,且随感染复数增加而增加.结论:采用腺病毒介导VEGF165转染脐静脉内皮细胞较脂质体法转染效率高,当M0I=50时可作为转染安全有效的条件.这为细胞转染技术在脐静脉内皮细胞的研究提供实验基础.
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真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达
背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化.目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况.方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNL CL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况.结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达.结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafA ORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1 ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3 ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达.
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pEGFP-ORF2质粒在Vero细胞中的有效表达
目的:确立pEGFP-ORF2质粒在不同细胞密度,不同转染时间,及血清存在与否时在细胞中的有效表达,为进一步研究HSV-2LAT ORF2对细胞的作用,及阐明HSV-2潜伏复发机制打下基础.方法:采用脂质体法将pEGFP-ORF2与pEGFP-C2两个真核表达载体转染Vero细胞,观察荧光蛋白表达.结果:有无血清对转染效果无明显差异.在细胞密度为4.0×104cells/ml,转染后84h EGFP表达量较其它条件下高,且在相同条件下pEGFP-ORF2与pEGFP-C2的表达无明显差异.结论:血清对表达效果的影响不大,细胞的接种密度及转染时间对转染有明显作用,以荧光蛋白作为标签鉴定蛋白表达的方法切实可行.
