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外源基因转染细胞技术的研究进展
随着基因与蛋白功能研究的深入,目前已建立了许多细胞稳定转染的方法,将外源基因导入细胞内已作为一种专业技术在农业、医学和生物制药等领域展现出巨大的应用前景,在基因治疗层面上,为很多疾病的基础研究和临床治疗提供了有力的保障.细胞转染技术是将外源基因导入真核细胞的技术.根据转染载体的不同,转染类型可分为病毒载体和非病毒载体转染,病毒载体转染主要包括逆转录病毒、腺病毒相关病毒载体转染,非病毒载体转染常见的有脂质体转染、纳米材料为载体的转染等.
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不同剂量结核病DNA疫苗的电转染免疫原性研究
目的 研究不同剂量结核病DNA疫苗电转染后的免疫原性.方法 40只BALB/c小鼠通过随机数字表法分为8组,每组5只.其中4组分别用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μg结核分枝杆菌Ag85A DNA肌内注射免疫小鼠;另4组用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μgAg85ADNA肌内注射加电转染免疫小鼠.每2周免疫1次,共3次.后1次免疫后2周杀死小鼠.用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)水平;用流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ的辅助性T细胞(helper T cell,Th)1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比,以及Th1与Th2的细胞比值.用SAS 9.2软件处理数据,实验数据以“-x±s”表示,对有关数据进行两因素析因设计的方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫结束后2周,小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,50 μg[(646.05±342.53) pg/ml]和100 μgAg85ADNA肌内注射组[(738.61±372.68) pg/ml]显著高于生理盐水组[(1.73±3.88)pg/ml](f值分别为4.065、4.647,P值均＜0.05)和10 μg Ag85A DNA组[(87.83±120.82)pg/ml](t值分别为3.513、4.094,P值均＜0.05);10 μg Ag85A DNA电转染组[(357.06±105.18) pg/ml]显著高于生理盐水组(t=2.247,P＜0.05),高于100 μg Ag85ADNA电转染组[(86.08±135.73) pg/ml],但差异无统计学意义(t=1.706,P＞0.05);50 μg Ag85ADNA电转染组[(648.60±439.41)pg/ml]显著高于生理盐水组(t=4.081,P＜0.05)和100 μg Ag85A DNA电转染组(t=3.539,P＜0.05).与直接肌内注射组IFN-γ水平[(87.83±120.82) pg/ml]比较,10 μg Ag85A DNA电转染组增高3倍[(357.06 pg/ml)/(87.83 pg/ml)]; 50 μg Ag85A DNA肌内注射组[(646.05±342.53) pg/ml]与电转染组[(648.60±439.41)pg/ml]比较,差异无统计学意义(t=-0.016,P＞0.05);100 μg Ag85A DNA电转染组[(86.08±135.73)pg/ml]较肌内注射组[(738.61±372.68) pg/ml]降低88.35％(t=4.105,P＜0.05).小鼠PBMC分泌IFN-γ的Th1细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA:(1.39±0.84)％;50 μg Ag85A DNA:(1.55±0.33)％;100 μg Ag85A DNA:(2.13±0.47)％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA:(1.42±0.47)％; 50 μg Ag85A DNA:(1.88±0.51)％; 100 μg Ag85ADNA:(1.43±0.68)％]均高于生理盐水组[(0.65±0.31)％](t值分别为2.002、2.431、4.015、2.084、3.332和2.105,P值均＜0.05),但不同剂量Ag85A DNA电转染组与肌内注射组之间差异均无统计学意义(t值分别为0.081、0.901和-1.91,P值均＞0.05).小鼠PBMC分泌IL-4的Th2细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA:(1.42±1.18)％; 50 μg Ag85A DNA:(1.14±0.78)％; 100 μg Ag85A DNA:(1.24±0.76)％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA:(1.19±1.09)％; 50 μg Ag85A DNA:(2.06±0.96)％;100 μgAg85A DNA:(1.47±0.65)％]均显著低于生理盐水电转染组[(4.14±2.55)％](t值分别为-3.392、-3.738、-3.616、-3.676、-2.599和-3.325,P值均＜0.05),但不同剂量DNA肌内注射组与DNA电转染组之间差异无统计学意义(t值分别为0.284、-1.139和-0.292,P值均＞0.05).结论 DNA电转染免疫可以增强低剂量DNA疫苗的免疫应答,使用少量的DNA疫苗就可以产生较好的免疫效果.
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不同类型的转基因细胞核供体对生产小鼠转基因克隆胚胎的影响
目的 利用体细胞核移植(SCNT)技术生产小鼠转基因克隆胚胎. 方法 利用所构建的含新霉素抗性(Neor)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体, 通过电穿孔的方法, 分别转染小鼠胎儿成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞,经G418筛选14d后用于核移植.同时以未转基因小鼠卵丘细胞和成纤维细胞为核供体,进行体细胞核移植. 结果 转基因与未转基因胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(154/160)发育率为19.23%和22.91%,差异不显著(P＞0.05);转基因胚胎干细胞与胎鼠成纤维细胞的重构胚的囊胚(152/154)发育率为41.54%和19.23%,差异显著(P＜0.05);未转基因卵丘细胞与成纤维细胞的重构胚的囊胚(171/160)发育率为41.17%和22.91%,差异显著(P＜0.05). 结论 利用体细胞核移植技术,小鼠胎儿成纤维细胞和胚胎干细胞可以有效地生产小鼠转基因囊胚.
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阴道毛滴虫病毒介导的EGFP在阴道毛滴虫细胞内的表达
目的 研究阴道毛滴虫病毒(Trichomonas vaginalis virus,TVV)介导外源基因进入阴道毛滴虫体内表达的能力,探索TVV作为双链RNA病毒转染载体的可能性.方法 根据TVV基因组的序列特征,用绿色荧光蛋白(EG-FP)编码基因替换TVV的全部或部分基因编码区,构建TVV与增强型EGFP编码基因的嵌合体pTVV-EGFP,其体外转录体经电穿孔方法转染携病毒阴道毛滴虫株,RT-PCR及SDS-PAGE方法检测EGFP的表达情况.结果 电穿孔转染后培养的虫体在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,且续传15代后仍然存在;RT-PCR检测到EGFP的mRNA,SDS-PAGE检测到转染后虫体及培养上清中有分子质量单位为27 ku的蛋白,与已知EGFP的分子质量相符.结论 TVV能成功介导外源性EGFP编码基因在阴道毛滴虫体内表达.
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犬贾第虫病毒感染性体外转录体制备及转染试验
目的 研究犬贾第虫病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性,为进一步研究犬贾第虫病毒的特性、深入阐明病毒的致病机理奠定基础.方法 根据已知的GCV(长春株)基因序列设计一套特异性重叠引物,利用RT-PCR 技术,构建感染性犬贾第虫病毒基因组全长cDNA ;用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System制备体外转录体,电穿孔方法感染无病毒株犬贾第虫滋养体,通过提取总核酸和超薄切片电镜观察感染情况.结果 成功构建犬贾第虫病毒基因组全长cDNA,体外转录体电穿孔后72 h,提取的总核酸中发现6.2 kb的dsRNA带,电镜观察到完整的病毒粒子.结论 该转录体具有感染性,可以在无病毒株犬贾第虫滋养体内复制表达,为进一步研究GCV奠定基础.
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电穿孔过程中细胞膜电导率变化条件下的跨膜电压研究
基于经典球形单细胞五层介电模型,并考虑电穿孔过程中细胞膜电导率的变化,对微秒脉冲电场作用下的细胞内外膜跨膜电压进行了仿真分析,以及脉冲电场诱导人宫颈癌细胞系Hela凋亡的实验研究.仿真分析发现,随着细胞穿孔程度的加剧,细胞膜电导率增加,内、外膜跨膜电压的比值不断增加,表明外加脉冲电场对内膜的影响不断增强,其作用靶点逐渐透过细胞膜进入胞内细胞器.同时,实验结果也表明随着脉冲电场场强不断增加,微秒脉冲电场所诱导的Hela细胞的凋亡率随之增加,从而间接证实了仿真分析的结果.现有研究普遍认为微秒脉冲电场的作用靶点为细胞外膜,本研究关于微秒脉冲电场对细胞内膜作用的研究结果是对已有研究的重要补充和发展.
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外电场作用下压控电穿孔模型的研究
根据电致压缩理论和临时亲水性通道理论,本研究构建了压控电穿孔模型(Voltage-Controlled Electroporation:VCEP Model).在Schwan方程中引入细胞膜的孔电导和静息电位,准确的描述了细胞膜在发生穿孔后的跨膜电压方程.从电学的角度描述膜孔的扩张过程,分析出膜孔的扩张力与孔电容上积聚电荷的关系.根据细胞膜有蛋白质骨架的生物机制,得到了细胞膜阻碍膜孔扩张阻力和膜孔半径的关系,建立了膜孔扩张和自修复的动力学方程.
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陡脉冲对恶性肿瘤细胞不可逆性电击穿的实验研究
采用作者研制的陡脉冲治疗装置,以人卵巢腺癌SKOV3细胞为实验研究对象,通过倒置相差显微镜实时观察细胞形态在陡脉冲电场作用下的动态变化过程,用扫描电镜观察细胞膜表面的变化情况,并用透射电镜观察细胞超微结构的改变.研究发现,陡脉冲作用后的细胞发生明显肿胀,细胞核固缩,扫描电镜观察结果显示出细胞膜出现孔洞并发生破裂,细胞质外喷;透射电镜观察结果发现核肿胀,核膜不完整,胞质内细胞器结构模糊,微绒毛肿胀,胞浆、线粒体肿胀、空泡化,细胞膜多处断裂.这表明陡脉冲能使恶性肿瘤细胞发生不可逆性电击穿并导致其死亡,有着良好的应用前景.
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绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究
本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率,同时观察绿色荧光蛋白(GFP)作为报告系统用于转染条件优化的可行性.目的基因以GFP为报告系统,通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞,荧光显微镜下观察并计算转染效率.结果表明:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,电穿孔转染效率在10%左右,而脂质体转染效率小于1%.结论:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件.
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稳定表达外源RbAp46基因的U937白血病细胞株的建立和初步特性分析
为建立RbAp46基因稳定转染的白血病细胞株,对悬浮培养的白血病细胞的电穿孔条件进行优化之后,运用电穿孔介导的转基因技术,在低电压、高电容的条件下将含RbAp46基因cDNA的表达质粒转染白血病细胞系U937,经G418筛选获得稳定转染的克隆,用PCR检测RbAp46基因的整合,用Western blot分析蛋白质的表达水平,然后筛选出表达外源RbAp46蛋白水平高的亚克隆.用台盼蓝拒染法判定细胞活力,用细胞计数判定细胞生长速率.结果发现,转染RbAp46基因的U937细胞的生长速率比对照组低50%左右.结论:在白血病细胞系U937中建立了稳定表达外源RbAp46基因的细胞株,并发现过表达的外源RbAp46基因能抑制U937细胞的增殖.
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胰腺癌纳米刀消融参数的设置原则与临床应用
纳米刀(不可逆电穿孔)已被证实为一项安全、有效的肿瘤消融治疗方法,近年其在局部晚期胰腺癌治疗中的应用体现出明显优势,但是对纳米刀相对复杂的消融技术参数的选择和应用还存在一定困难.本文主要对纳米刀消融术在胰腺癌治疗中的优势、消融方式选择以及消融参数设定等进行综述.
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电穿孔技术的研究及应用进展
脉冲电场的电穿孔效应已作为一项单独的技术在医学上被广泛应用,其机制是高强度电脉冲引发细胞膜结构一过性改变,致暂时可逆性膜渗透性增加,膜上出现亲水性孔道,即电穿孔(electroporation)[1],其可促进非渗透性外源性大分子物质,诸如基因、药物等进入细胞内.特别是癌症的电化学治疗,由日本学者Okino[2]创立于80年代末,利用高场强电脉冲的膜穿作用辅助化疗药物,如博来霉素等治疗肿瘤,这样使不易透过脂质双分子层膜的化疗药物易进入细胞内,从而增敏化疗,不但降低博来霉素全身使用剂量,同时减少了细胞毒药物的全身毒副作用,现今癌症的电化学疗法(electrochemotherapy,ECT)已逐渐成为癌症综合治疗的有效补充手段之一.
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SEA和喉癌MAGE-A3构建的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠体内的转录
目的：检测真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠中的转录。方法将葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal endotoxin A，SEA）和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3， MAGE-A3），构建成基因共表达的真核质粒 pMAGEA3-IRES-SEA。将pMAGEA3-IRES-SEA用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌，每2周1次，每次注射50μg，共免疫3次。末次免疫2周后，取注射部位组织，用荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测目的基因在注射部位肌肉中的转录情况。结果在实验小鼠注射部位的骨骼肌内检测到 SEA、MAGE-A3基因转录mRNA。结论所构建的pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒，可通过电转染的方式，在小鼠体内能有效地转录。这为研究该质粒通过小鼠的体内转录蛋白的表达，诱导机体细胞免疫、体液免疫来清除喉癌，奠定了理论基础。
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应用细菌人工染色体技术体外繁殖人巨细胞病毒
目的体外快速繁殖人巨细胞病毒（ HCMV）。方法用试剂盒抽提、纯化重组HCMV细菌人工染色体（BAC），以重组HCMV细菌人工染色体（BAC-HCMV）为模板扩增UL82基因，酶切后连接至pcDNA载体，构建pcDNA-pp71重组质粒，转化感受态宿主菌，抽提及鉴定重组质粒。通过电穿孔技术将BAC-HCMV与鉴定成功的pcDNA-pp71重组质粒共转染人包皮成纤维细胞，通过多重PCR法及观察细胞病变效应、绿色荧光蛋白等方法鉴定培养后获得的HCMV。结果（1）获得pcDNA-pp71重组质粒，经PCR及双酶切后，片段大小与预期相符，进一步测序鉴定成功。（2） BAC-HCMV与pcDNA-pp71共转染人包皮成纤维细胞，出现细胞病变效应，经荧光显微镜观察可见绿色荧光。（3）以培养出的病毒DNA为模板进行多重PCR扩增，获得两条与预期大小相符的条带，鉴定HCMV体外繁殖成功。结论应用BAC技术成功在体外快速繁殖HC-MV，为HCMV研究提供实验材料，也为进一步研究HCMV分子机制奠定基础。
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纳米刀治疗原发性肝癌研究进展
我国原发性肝癌(肝癌)发病率和病死率分别居恶性肿瘤的第 4 位和第 3 位 [1-2].手术切除是治疗肝癌的标准方式,但肝癌起病隐匿,仅有不到20％ 的就诊患者具备手术条件 [3].近年来,局部热消融如射频消融(RFA)及微波消融(microwave ablation,MWA)等方式因临床疗效确切及微创优势,已成为肝癌治疗的重要选择 [4].然而,局部热消融过程产生的高温会对组织产生无选择性破坏,因此对于治疗位于邻近重要管道如胆管或动静脉等高危部位的肝癌具有一定的局限性,同时由于"热沉效应"的影响,RFA 等治疗方式的进一步应用受到限制.纳米刀作为一种新兴的局部消融技术,因其不依赖高热,可以有效治疗特殊部位的肿瘤,具有广阔的应用前景.目前该项技术已经开始应用到肝癌的临床治疗,本文将就纳米刀的工作原理及应用发展展开阐述.
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电穿孔介导的pIRES-hVEGF165-EGFP转染对牵引成骨过程中早期血管生成的影响
目的 探讨电穿孔介导的基因治疗对下领骨牵引成骨过程中早期血管生成的影响.方法 32只新西兰大白兔随机分为4组:质粒+电穿孔组(A组),质粒组(B组),生理盐水+电穿孔组(C组),空白对照组(D组).各组动物分别于注射后1、3、7、14 d处死,取牵引区组织进行组织学检查、电镜观察、CD34免疫组织化学染色及微血管密度检测.结果 A、B组血管内皮细胞呈增殖活跃状态;C、D组多数血管内皮细胞部分呈现退变及凋亡早期改变.免疫组化染色发现,转染后第1天血管壁内皮细胞浆CD34表达较弱;第3、7、14天,牵引区肉芽组织血管内皮细胞均出现CD34阳性表达.A组CD34阳性表达较B组强,A、B组的CD34表达持续阳性且呈上升趋势;C、D组表达弱,CD34阳性表达维持在第1天水平上平稳波动.结论 电穿孔介导的pIRES-hVEGF165-EGFP重组质粒体内转染能够促进牵引区早期微血管的生成,使局部血管增生、渗入,增加骨断端的血流量.对调节和促进骨的生长和修复过程具有重要作用.
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基因治疗对下颌骨牵引过程中碱性成纤维细胞生长因子表达的影响
目的 探讨电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)表达的影响.方法 新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,术后3d开始以0.8 mm/d速度行下颌骨牵引,连续牵引7d,将实验动物分为:A、B、C、D、E5组.分别在牵引区注射2μg重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165、空质粒pIRES及生理盐水.各组实验动物均施加电穿孔刺激.各组分别于固定期第7、14、28天处死动物取材行免疫组织化学检查bFGF的表达,并利用病理图像分析系统进行分析.结果 bFGF在肉芽中的成纤维细胞、单核巨噬细胞、多核巨噬细胞、间质细胞、成骨细胞和骨细胞中表达:1周时以C组表达较强,2、4周时以A、B、C组表达仍较强,A、B、C组与D、E组相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 电穿孔介导的基因治疗能使bFGF在牵引区的表达增强和表达时限延长,发挥其生理作用,促进细胞的分裂增殖与分化及牵引区细胞基质的形成和新骨生成.这可能是基因治疗促进牵引区新骨生成的机制之一.
关键词： 电穿孔 基因疗法 骨生成 碱性成纤维细胞生长因子 -
基因治疗对兔下颌骨牵引过程中骨形成蛋白-2表达的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)表达的影响.方法 新西兰大白兔双侧下颌骨截骨,术后3d开始牵引,连续牵引7d后,将实验动物分为A、B、C、D、E5组,A、B、C组分别在牵引区注射2 μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、pIRES-hVEGF165.D组与E组分别注射相同剂量的空质粒(pIRES)和生理盐水(NS).各组分别于固定期第7、14、28天处死动物,取材行免疫组织化学检测BMP2的表达情况,并利用病理图像分析系统进行分析.结果 BMP2主要在肉芽组织中的炎细胞及新生幼稚骨小梁表面的细胞组织中表达.固定7d时表达强烈,各时点基因治疗组明显强于对照组.结论 电脉冲介导的基因治疗能使BMP2在牵引区的表达增强和表达时限延长并促进细胞的分裂增殖与分化,促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成.
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不同时机转染基因对兔下颌骨牵引区新生骨骨密度与骨强度的影响
目的 观察不同时机转染基因对兔下颌骨DO过程中牵引区新生骨骨密度与骨强度的影响,探索基因导入的佳转染时间,以获得更好的治疗效果.方法 新西兰大白兔48只,全麻下行双侧下颌骨截骨及牵引器植入后,采用随机区组法分成A、B、C、D4组,分别于术后即刻、术后3d(牵引开始时)、牵引结束时,于双侧牵引区分别注射2 μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165；A、B、C3组均予电穿孔刺激,D组单纯牵引不行基因转染.各组于术后3d开始以每天0.8 mm、每天1次的速率进行牵引,连续牵引10 d；各组分别于固定期1、2、4、8周处死3只兔子,切取下颌骨行X线片检测、定量CT(quantitative computer tomography,QCT)测量牵引区新生骨组织密度后,将4、8周的标本进行生物力学检测.结果 各组牵引间隙新生骨骨密度与骨强度,随着固定期的延长逐渐增高；固定1周时,A(83.43 ±9.96)、B(92.29±11.25)、C(89.93±14.15)3组新生骨骨密度组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05),但均高于D组(70.31±3.30),差异有统计学意义(P＜0.05)；固定2、4、8周时B组骨密度(137.54±7.20、492.93±17.57、790.48±12.19)高于A组(121.44 ±9.27,396.15±15.70,603.39±16.46)、C组(125.06±7.24,464.15±15.45,764.15±17.28)、D(98.86±8.13,336.45±11.95,577.89±18.43),差异有统计学意义(P＜0.05),固定4、8周时B组生物力学各项指标均高于A、C、D组(P＜0.05).结论 在牵引开始时(牵引期)进行基因转染,能够获得佳的促进新骨生成的效果,提示牵引期是下颌骨基因治疗的佳时机.
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电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引区新生骨骨密度与强度的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对下颌骨DO过程中牵引间隙新生骨密度与强度的影响,从而为促进下颌骨DO新骨生成,缩短牵引周期,减少并发症提供新思路.方法 以新西兰大白兔为实验动物模型,于术后3 d开始下颌骨牵引,每天0.8 mm,连续牵引7 d后,将实验动物分为5组.A组:在牵引区注射2 μg(O.1μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2;B组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)重组质粒pIRES-hBMP2;C组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165;D组:在牵引区注射2 μg(0.1μg/μl)空质粒pIRES;E组:在牵引区注射相同剂量的生理盐水.5组实验动物均施加电穿孔刺激.各组分别于固定期第1、2、4、8周行X线及QCT检查.选整个牵张间隙新生骨痂部分为兴趣区,测定骨密度.然后处死动物.取材测量牵引区新生骨的三点抗压强度.结果 A、B、C组新生骨痂密度各时相点新生骨痂密度明显高于D、E组(P<0.01).固定2周,A组明显高于各组,但B、c组间比较差异无统计学意义.固定4周,A、B组明显高于C、D、E组(P<0.01).固定8周A组明显高于B、c、D、E组(P<0.01).B、C组间比较差异无统计学意义,但高于D、E组(P<0.01).固定4周,A组新生骨的三点抗压强度明显高于B、C、D、E组(P<0.01).固定8周,A组仍明显高于各组(P<0.01),且B组也明显高于c、D、E组(P<0.05).结论 电脉冲介导的pIRES-hVEGF165-hBMP2重组质粒体内转染可使牵引区获得较满意的骨再生和骨化成熟进程,其新骨骨化、改建过程均超过对照组.提示联合应用BMP与VEGF,可能会实现成骨与血供的联合重建,并且使单一生长因子的效应放大,使骨愈合的速度加快.
