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脂质体转基因应用的研究进展
脂质体(liposome)特别是阳离子脂质体(cationic liposome)作为一种基因转运工具得到了广泛的应用。与其它非病毒基因转运系统一样，它具有生产简便、毒性低、无感染危险等优点［1］。脂质体介导的转染技术已被广泛应用于将外源性基因导入哺乳动物细胞的研究中。本文就近年来脂质体在真核细胞和真核生物中转基因应用的研究进展做一回顾。 一、在治疗肿瘤方面的应用：脂质体作为一种转基因的载体，被人们纷纷应用于通过转移不同的外源基因来达到治疗各种肿瘤的目的。Meye等［2］用阳离子脂质体将表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的外源基因转入自行建立的两种肉瘤细胞株(L MS6-93，US8-93)中，转染后24小时，高达37%的细胞表达GFP，24～48小时转染效率高，72小时后GFP表达下降。该实验表明，对于粘附生长的肿瘤细胞用脂质体转染是一种有效的转基因手段。Kurane等［3］针对腺癌设计了一种高度特异的转基因方法：他们用抗Lewis Y抗原(Lewis Ya ntigen,LYA)的单克隆抗体与含有嵌合的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)启动子的质粒和阳离子脂质体的复合物，转染能产生CEA且LYA阳性的腺癌细胞株，结果获得的转基因表达比不产生CEA且LYA阴性的腺癌细胞株高200倍。更有意义的是，Li等［4］发现即便不用脂质体转运外源基因而单独用脂质体处理细胞后，即可明显诱导内源性干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)产生干扰素。脂质体在宿主细胞内诱导干扰素合成的这种能力，对肿瘤性疾病的基因治疗是非常有用的。
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肝特异性假病毒转运系统的构建
目的:探索一种针对慢性乙型肝炎的特异性长效基因治疗手段.方法:改造乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)为基因治疗载体,敲除其所有的开放阅读框(open reading frames,ORFs),同时保留包装信号序列,并且插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因.同时构建辅助细胞系,为上述病毒载体(假病毒)提供包装所需要的病毒蛋白.以该假病毒载体转染辅助细胞系,以酶联免疫方法检测细胞培养上清中乙型肝炎病毒抗原,并在荧光显微镜下观察EGFP的表达,用透射电镜观察培养上清中的病毒颗粒,同时用实时定量PCR的方法对分泌到细胞培养上清中的假病毒进行了定量检测.结果与结论:以假病毒载体转染辅助细胞后,电镜观察到培养上清中乙肝病毒的丹氏粒(Dane particle).实时定量PCR分析结果显示,细胞分泌到培养上清的假病毒含量达103拷贝/μl.ELISA结果显示该上清中同时表达了HBV表面抗原和e抗原,通过荧光显微镜观察发现外源基因绿色荧光蛋白获得有效表达.
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DDCTMA阳离子脂质体对人喉癌细胞的毒性作用机制
目的 研究DDCTMA阳离子脂质体对体外培养的人喉癌细胞系(Hep-2)细胞增殖和凋亡作用影响,进而分析其细胞毒性作用机制.方法 采用MTT法检测不同质量浓度DDCTMA阳离子脂质体作用下的细胞存活率,据此选择适当质量浓度的DDCTMA阳离子脂质体分别处理Hep-2细胞,使用活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒、Hoechst 33258检测法及TUNEL原位测定法进行凋亡细胞形态学鉴定.定量检测酶caspase-3和caspase-9的酶活力变化.结果 随着DDCTMA阳离子脂质体质量浓度的增大,细胞存活率逐渐下降;活细胞减少,坏死和凋亡细胞数量都增加;对细胞核的染色能观察到凋亡细胞数量呈倍数增加,呈现浓度依赖性;caspase-3和caspase-9的酶活力也有相应增高.结论 DDCTMA阳离子脂质体对Hep-2细胞的毒性作用表现是:DDCMA阳离子脂质体质量浓度在9 ～48 mg·L-1内主要诱导部分细胞凋亡,质量浓度超过48 mg·L-1主要引起细胞坏死.
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肺部给药的研究进展
肺部给药治疗呼吸道疾病,临床上已有较广泛的使用,近年来又着手研究肺部给药作为全身给药途径,以及作为基因转运手段治疗肺部疾病,现就发展状况作一介绍.
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聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒基因载体的制备及相关性质的体外研究
目的优选制备可载带质粒DNA的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(PBCA-NPs)的工艺条件,并研究其体外生物学特性.方法选用乳化聚合法制备PBCA-NPs,采用正交实验法,以激光粒度分析仪及原子力显微镜(AFM)综合分析实验结果来确定优化的制备条件.用阳离子表面活性剂十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)对纳米粒进行表面修饰后连接质粒DNA,并分析PBCA-NPs及CTAB修饰的PBCA-NPs的细胞毒性效应、DNA装载效率、PBCA-NPs-DNA抗超声破坏和抗DNaseI的降解作用及其在体外的基因转染能力.结果激光粒度分析仪及原子力显微镜结果表明,PBCA-NPs粒形圆整,大小均匀,平均粒径106nm.琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定DNA装载量达93%.该纳米粒能显著提高质粒DNA抵抗核酸酶降解和超声波剪切的能力.细胞转染实验表明,该纳米粒传递质粒DNA进入HepG2和3T3细胞的效率较高.结论利用该制备工艺生产出的具备良好生物学特性的PBCA-NPs是基因转运和基因治疗中极具应用潜力的非病毒载体.
关键词： 聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA) 纳米粒(NP) 基因转运 基因治疗
