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腺病毒载体在皮肤科基因治疗中的应用
腺病毒载体是经去除腺病毒基因组的某些区而获得的,由于其诸多优点,正在成为皮肤科基因治疗中使用多的载体之一,本文就腺病毒载体的特点及其在皮肤科基因治疗中的应用进展,作一综述.
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黄病毒的感染性克隆和嵌合突变体
感染性克隆技术已广泛应用于深入阐明黄病毒致病机理、构建病毒载体等研究领域,其中利用感染性克隆构建嵌合突变体是黄病毒疫苗研究中很有希望的新途径.本文就该研究的新进展作一简要综述.
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脊髓灰质炎病毒载体研究进展
脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员,是单正链RNA病毒.从上世纪八十年代以来,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型.近年,脊髓灰质炎病毒载体用于在中枢神经系统中定点表达外源蛋白,引起了人们的重视.本文对脊髓灰质炎病毒载体的类型、特点、应用及新进展作一综述.
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抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展
乙型肝炎病毒(HBV)是严重威胁人类健康的一种病毒,特别是在我国约有1.2亿人为HBV携事业者,占世界的1/3.对已感染HBV者,常用的化学及免疫疗法通常无效.今年来,研究者试图利用反义技术,通过在基轩表达水平上抑制HBV的复制,来达到治疗HBV感染的目的.核酶是具有RNA裂解活性的RNA分子,能特异地结合并切割靶RNA分子.HDV核酶唯一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型,研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势.本文就HDV核酶靶位点的筛选、病毒载体导入系统、靶向性分子的构建等热点问题的研究新进展予以综述.
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基因治疗的危险性
1 人体基因治疗试验的危险性病毒感染的细胞,通常不只一种.这样,当病毒载体携带基因进入人体,它们改变的不仅是靶细胞.
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利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒
人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41.首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5 E4orf6编码区;将HAdV-5 E1A增强子克隆至HAdV-41 E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE.该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP.pAd41 E4EE-GFP经Pme Ⅰ酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP.经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0 ml浓度为8.0×1010 vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×109 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5 E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确.本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的.
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猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112弱毒株NSP2区表达猪瘟病毒E2基因表位的研究
建立共表达猪瘟病毒(Classic swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要中和性抗原表位基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,为进一步研究PRRSV作为病毒载体提供实验数据.本研究在PRRSVHuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因插入HuN4-F112弱毒株PRRSV已鉴定出的两个NSP2蛋白的复制非必需区,经基因片段的克隆、拼接,构建了两株含有CSFV E2蛋白的主要中和性抗原表位基因的感染性PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ508-532+ E2和psk-HuN4-F112-Δ480-532+ E2.用限制性内切酶Swa Ⅰ分别将两株共表达的感染性克隆线性化,之后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法分别将病毒RNA转染BHK-21细胞包装出病毒粒子,再分别将其转接到MARC-145细胞传代拯救出两株病毒.分别对两株拯救病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定.结果表明,两株拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(拯救病毒基因组的14 667位因同义突变产生的MluⅠ酶切位点)和插入基因序列.间接免疫荧光试验表明,CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因均能在两株拯救的PRRSV中表达,且能够在其传代过程中稳定遗传.病毒生长特性结果比较显示两株拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性.本研究构建了两株共表达CSFV E2蛋白主要中和性抗原表位基因的PRRSV感染性克隆并获得了拯救病毒,且外源基因能在拯救病毒中稳定表达,为进一步开发新型PRRSV二联疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性cDNA 拯救病毒 病毒载体 -
Ad5F35重组腺病毒载体研究进展
在分子生物学领域,腺病毒载体是将外源基因导入动物细胞内经常使用的载体之一.由于其靶细胞种类多,转导效率高,对增殖期及静止期细胞均有很高的转导效率,不整合到宿主基因组中,不会引起插入突变,理化性质较稳定,易于分离纯化,可容纳较大的目的基因片段等优势,因而被广泛用于基因治疗、体外基因转染及基因疫苗制备等实验及临床研究中,其中Ad5F35型腺病毒载体为近年来研究热点之一,此文就其研究进展作一综述.
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表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定
以脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)作为病毒载体,寻找基因组里理想的外源基因插入位点,为构建多价疫苗奠定基础.猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种疾病.脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主谱广,能够天然感染多种哺乳动物.本研究采用EMCV NJ08毒株cDNA感染性克隆,将PCV2 ORF2基因插入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氨基酸之间,拯救获得重组EMCV rNJ08/Cap,拯救病毒含有分子遗传标记.Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白.重组病毒rNJ08/Cap在BHK-21细胞上生长曲线和病毒蚀斑大小与亲本病毒NJ08相似,证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础.
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黄病毒载体技术
随着人们对病毒生活周期、分子生物学及其与疾病发生发展关系的深入认识,病毒载体逐渐成为科学研究的焦点和热点.病毒载体作为一种基因导入系统,在疫苗和基因治疗中发挥极其重要的作用,一些以病毒作为载体的疫苗和基因治疗药物已进入临床研究阶段,并取得了很大的进展.本文拟对目前黄病毒载体技术的新进展作一综述.
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中枢神经系统疾病的基因治疗
基因治疗正在成为常规方法难以治愈的中枢神经系统疾病的新的治疗手段.本文概要介绍了中枢神经系统疾病基因治疗的方法和途径;中枢神经系统疾病基因治疗的病毒载体以及目前中枢神经系统疾病基因治疗研究的状况.
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基因治疗脊髓损伤研究进展
脊髓损伤在全世界都有较高的发病率,迄今为止,临床上脊髓损伤后功能恢复仍非常困难.现在认为中枢神经系统再生困难主要是因为损伤处微环境不适合轴突再生,其中损伤处缺乏神经营养因子类物质被认为是主要的原因之一.近年来,人们将神经营养因子基因导入损伤处对脊髓损伤进行基因治疗取得了一定的研究进展,本文对基因治疗脊髓损伤的目的基因、病毒载体和靶细胞等进行了综述.
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HSV介导的神经营养因子-3体外表达拮抗顺铂的耳毒性作用
目的观察单纯疱疹病毒(HSV)扩增子型表达载体介导的神经营养因子-3(NT-3)体外表达对顺伯耳毒性的拮抗作用. 方法以HSV扩增子型表达载体为基础,构建由CMV作启动子,表达c-myc标记的大鼠NT3或鼠的小肠碱性磷酸酶(MIAP)的HSVnt3和HSVmaip扩增子型表达载体.通过无辅助病毒的包装体系包装后,感染体外培养的耳蜗器官,经不同浓度的顺铂处理48h后,观察转导NT-3或报告基因(MIAP)后的耳蜗螺旋神经节细胞存活和神经突起的再生. 结果显示在病毒滴度(MOI)为0.25时,HSVnt3感染体外培养的耳蜗48h后,能够刺激耳蜗分泌较高水平的NT-3(3μg/L).用不同浓度的顺铂处理48h,HSVnt3转导的耳蜗螺旋神经节细胞可以在一定范围内,耐受顺铂的耳毒性作用,与HSVmiap转导的耳蜗比较,神经元残留的数量明显高于对照组(P<0.001),耳蜗螺旋神经节细胞神经突起的长度和密度也与对照组有明显的差别(P<0.001). 结论提示无辅助病毒的HSV所介导的神经营养因子-3表达,能够在体外拮抗顺铂的耳毒性作用.
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病毒预防靠病毒
异源基因转导细胞的重组病毒运载技术在各种基础与应用研究中已有几十年的历程.Darnell和同事利用重组腺病毒研究白蛋白启动子转录调控,属于早期应用实例之一[1].随着小鼠复制缺陷性反转录病毒问世,基因治疗的实验室研究进入了飞跃时期[2].该领域的研究热点为寻找各种DNA/RNA病毒载体或非病毒性载体[3-5].不久前,载体技术的思路已被引入基因疫苗的开发工作[6-10],这正是本系列综述所要涉及的主题.
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微型核酶对贾第虫组织蛋白酶B基因体外转录体切割效果的研究
目的 检测微型核酶对篮氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)组织蛋白酶B基因体外转录体的切割效率. 方法 用RNA draw软件对贾第虫组织蛋白酶B基因序列二级结构进行模拟分析,并按照微型核酶设计的原则,选取合适的核酶切割位点,设计微型核酶序列,构建含贾第虫组织蛋白酶B基因短反义序列和长反义序列的两个微型核酶嵌合型犬贾第虫病毒重组质粒(CRzS和CRzL),以三磷酸甘油醛脱氢酶基因的微型核酶(GRzL)和无核酶的组织蛋白酶B基因(PCB)重组质粒作对照.将重组质粒线性化后体外转录为mRNA,然后用微型核酶体外切割组织蛋白酶B基因转录体,采用实时荧光定量PCR检测切割效率. 结果 微型核酶CRzS和CRzL对组织蛋白酶B基因转录体切割效率分别为75.42％和83.14％,微型核酶GRzL的切割效率为0.02％,无核酶PCB切割效率为23.0％. 结论 微型核酶可有效切割贾第虫组织蛋白酶B基因转录体,为开展体内抑制组织蛋白酶B基因表达试验奠定了基础.
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缺失TC7L-TK2L基因减毒天坛株痘苗病毒构建及筛选
目的 通过敲除天坛株痘苗病毒(Vaccinia virus Tiantan strain,VTT)的复制非必需基因TC7L-TK2L,并结合双标记筛选及外源筛选标记敲除技术构建TC7L-TK2L基因缺失的VTT弱毒株rVTT-TC7L--TK2L-. 方法 人工合成含有痘病毒早晚期复合强启动子pE/L和外源筛选标记增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的重组臂,构建穿梭质粒pTC7L-TK2L-EGFP,再与VTT共转染BHK-21细胞,通过连续筛选10次,获得含有筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L-TK2L--EGFP+;利用Cre/loxp系统敲除EGFP,连续筛选10次,获得无筛选标记的重组痘苗病毒rVTT-TC7L--TK2L-,用PCR方法对rVTT-TC7L--TK2L-进行鉴定和遗传稳定性检测,用电镜观察病毒形态变化,并通过绘制生长曲线观察病毒在细胞内的复制情况. 结果 PCR结果表明,成功构建了重组痘苗病毒rVTT-TC7L-TK2L-,且具有良好的遗传稳定性;电镜观察痘苗病毒缺失TC7L-TK2L基因未影响病毒形态;生长曲线显示敲除TC7L-TK2L基因后病毒毒力显著下降,但不影响病毒的正常复制. 结论 成功构建了痘苗病毒减毒株rVTT-TC7L--TK2L-,该重组痘苗具有良好的遗传稳定性且毒力减弱.
关键词： 重组天坛株痘苗病毒 病毒载体 同源重组 TC7L-TK2L基因 -
重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展
近年来，研究者致力于突破基因治疗的瓶颈，极大推动了基因治疗的发展。载体系统是基因治疗的基础，截止2013年7月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”网站登记注册的基因治疗方案中，重组腺病毒载体占476项（23.5%）。在6个亚群（A-F）、50多种血清型的腺病毒载体中，5型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特异性识别并结合多种正常组织高表达的柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）从而进入细胞发挥作用，基因转导效率高，因此，Ad5是目前应用广泛的腺病毒载体。
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聚乙烯亚胺用作基因转染载体的研究进展
基因载体问题以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性和安全性等问题,是基因治疗领域亟待解决的关键问题之一.聚乙烯亚胺(PEI)是阳离子聚合物非病毒载体的典型代表[1],是一种很早便为人所知并予以应用的有机大分子.目前,以PEI阳离子聚合物与DNA形成的PEI/DNA复合物已成为非病毒基因载体的研究热点.本文就近年来这方面的研究进展作简要综述.
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腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用多的病毒载体之一.为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作.本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下.
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新一代腺病毒载体研究进展
由于腺病毒载体具有高核转移效率,对人致病性低等优点,所以在众多的载体系统中脱颖而出,成为基础研究、基因治疗和重组疫苗开发等领域中的重要工具.至今腺病毒载体已经发展了3代:第1代腺病毒载体(通常来源于Ad5和Ad2)主要是去除了E1和(或)E3区;第2代腺病毒在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2和(或)E4区;然后人们对腺病毒进行彻底的缺失,发展了第3代腺病毒载体,即high-capacity Ad vectors(HC-Ad),它仅含有ITRS和包装信号.
