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脊髓灰质炎病毒载体研究进展
脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸病毒科成员,是单正链RNA病毒.从上世纪八十年代以来,人们一直致力于发展脊髓灰质炎病毒载体,先后出现了抗原嵌合载体、PV复制子、多聚蛋白融合载体及双表达载体等类型.近年,脊髓灰质炎病毒载体用于在中枢神经系统中定点表达外源蛋白,引起了人们的重视.本文对脊髓灰质炎病毒载体的类型、特点、应用及新进展作一综述.
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多种HIV B'/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达及免疫效果研究
为了解多种HIV B'/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达水平及对免疫效果影响,使用复制型DNA疫苗载体pSCK2,分别构建了7种含单种或多种HIV B'/C亚型基因gagpol、gp160和rtn(rev、tat和nef融合基因)的DNA疫苗质粒.免疫荧光检测表明,Gag、Gp160、Rev、Tat和Nef蛋白均能从相应7种DNA疫苗中表达,单基因表达质粒中的基因表达水平和双基因表达质粒中IRES上游的基因表达水平普遍较好.小鼠免疫后,Gag能诱发较高的抗体滴度,Gp160、Pol和RTN的抗体滴度很低;比较研究显示,Gag单独表达和Gag与RTN双表达的质粒均能诱发较好的Gag抗体反应,但Gag与Gp160双表达质粒免疫或含Gag、Gp160和RTN质粒联合免疫的Gag抗体反应均较弱.ELISPOT检测表明,7种DNA疫苗单独或不同组合方式免疫均能诱发针对Gag、Pol、Gp160、Tat和Nef的细胞免疫反应;单基因表达质粒单独免疫诱发的细胞免疫反应好,含gagpol和gp160双基因表达质粒单独免疫或与含其它基因质粒联合免疫诱发的Gag、Pol和Gp160细胞免疫明显低于含Gagpol或Gp160单基因质粒诱发的相应免疫反应,但诱发的Tat和Nef细胞免疫与相应单基因质粒免疫组无明显差别.本研究结果显示,不同表达构建体的多种HIV B/C亚型的基因gagpol、gp160和rtn均能从pSCK2质粒中较好地表达;不同基因结构和不同组合免疫的优化,特别是含gag和gp160基因疫苗联合免疫程序的进一步优化对提高其免疫效果是必要的.
关键词： HIV-1 DNA疫苗 复制子 体液免疫 细胞免疫 -
兔出血症病毒复制子的构建及其在RK-13细胞中的复制
为研究兔出血症病毒(RHDV)的复制机制、病毒与宿主之间的相互作用以及致病机制等,创建一个安全、有效的技术平台,在前期构建的RHDV侵染性克隆基础上,将病毒的衣壳蛋白编码区删除,保留了RHDV复制必需的所有蛋白酶基因和两端的非编码区,构建了RHDV复制子.试验结果证明,将该复制子RNA导入RK13细胞中后,能够进行高水平的复制和表达.
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Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较
比较Semliki森林病毒(SFV)衍生的复制型DNA疫苗载体(复制型载体)和常规非复制型DNA疫苗载体(非复制型载体)的导入效率、表达效率、诱导凋亡率和免疫效果,从而评价其作为DNA疫苗载体的应用前景.使用等量SFV载体和常规DNA载体同等效率转染细胞后,复制型载体表达强度比非复制型载体高约3倍,其诱导凋亡的能力是非复制型载体的11倍;以不同剂量的SFV载体和常规DNA载体分别转染BHK21细胞,复制型载体各剂量组载体的表达量均高于非复制型载体.复制型载体在1μg组出现峰值,而非复制型载体则出现在4μg组.体内免疫的结果表明,SFV载体pSCA-SS1免疫的各组小鼠中,低剂量1μg组小鼠的总抗体滴度高于10μg和100μg剂量组;1μg pSCA-SS1免疫的小鼠产生的总抗体滴度与CTL水平,分别与pcDNA3-SS1免疫的小鼠中10μg和100μg组相当.但10μg、100μg组pSCA-SS1免疫小鼠的总抗体及CTL水平,都低于pcDNA3-SS1免疫的小鼠的10μg、100μg组.结果提示:SFV衍生的复制型DNA疫苗载体,在低剂量组时即可诱生与常规DNA疫苗载体高剂量组相近的免疫效果.
关键词： DNA疫苗 Semliki森林病毒 复制子 凋亡 -
含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达
目的 构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体,并实现其在细胞中的复制表达. 方法 用分子生物学基因克隆技术对HCV 2a型复制子的基因进行改造,用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1-EGFP,经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定;脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh-7细胞,用荧光显微镜观察EGFP表达,采用半定量RT-PCR方法检测重组复制子的HCV RNA负链,采用Western blot检测HCV NS3蛋白的复制表达,并观察IFN-α对重组质粒表达的HCV RNA复制的抑制作用. 结果 构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符,HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变,转染重组载体Huh 7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCV NS3蛋白表达.转染后48 h,1 000 IU/ml和2 000 IU/ml IFN-α处理的细胞HCV RNA表达水平分别为未处理组的20.0％和7.6％. 结论 含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNA-JFH1-EGFP构建成功,在Huh 7细胞中能有效复制表达,为进一步研究HCV提供了实验平台.
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乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体的构建及鉴定
目的 构建乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体,为进一步研究以乙脑病毒为载体的新型疫苗奠定基础.方法 (1)构建了两个乙脑病毒复制子:一个为完全缺失PrM/E基因(命名为Full △prM/E Replicon);一个保留E基因C端213 bp(命名为Partial △prM/E Replicon),并代之以多克隆位点.(2)将复制子RNA转染BHK-21细胞,于24、48、72、96 h采用Real-time PCR验证复制子的自主复制能力.(3)于复制子多克隆位点处插入YFP报告基因,并将含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞,采用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测验证YFP的表达.结果 (1)两个复制子RNA转染BHK-21细胞后,RNA有随时间增加而不断增多的趋势.(2)含报告基因的复制子RNA转染BHK-21细胞后,荧光信号持续增强,表达YFP的阳性细胞率也逐渐增多.结论 构建的乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体Full △prM/E Replicon及Partial △prM/E Replicon具有自主复制能力及对外源蛋白的表达能力.
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丙型肝炎病毒JFH-1株在细胞培养中的复制
1989年确认丙型肝炎病毒(HCV)为丙型肝炎病原体后,因其宿主范围仅限于黑猩猩和人,一直不能在常规培养细胞中复制,1999年Lohmann等[1]开发出HCV复制子技术,使HCV非结构区亚基因组RNA在Huh-7细胞中能够复制,成为研究HCV复制机制的有力工具.
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HCV细胞培养系统研究进展
我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法.由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HCV动物模型及感染细胞系统.如能建立一个有效的体外复制系统,对研究HCV的附着、融合、内吞、入胞、复制、释放和发病机制等有重要意义.本文就近年来国内外出现的HCV体外感染细胞系统的研究新进展进行综述,重点对稳定性较好的HCV体外细胞培养模型和HCV假病毒感染颗粒加以阐述.
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HBV复制子pHY106-BHBV转染HepG2细胞基因表达差异
目的:研究乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱的差异,分析参与胆固醇代谢的差异表达基因.方法:应用包含20 000条人类全长基因的寡聚核苷酸芯片ImaGene3.0检测乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系基因表达谱差异,并选择其中参与胆固醇代谢的表达下调基因7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶,用RT-PCR方法进行验证分析.结果:基因芯片筛选出差异表达的基因,其中包括转录因子、细胞周期素、细胞因子相关蛋白、糖脂类物质代谢相关酶及细胞信号转导相关因子等,RT-PCR验证参与胆固醇代谢的几种表达差异的基因,其中7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶表达明显下调,与基因芯片分析结果一致.结论:乙型肝炎病毒复制子pHY106-BHBV转染肝癌细胞系存在基因表达差异,乙型肝炎病毒感染可能通过抑制参与胆固醇代谢的7-脱氢胆固醇还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶从而进一步影响机体胆固醇代谢.
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丙型肝炎病毒复制子的研究
0引言丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的感染是急、慢性肝病的主要致病因素之一,他的感染通常是亚临床的,或只出现轻微的症状,但大约80%的患者难以清除病毒,发展为慢性感染,从而更易演变为肝硬化和肝细胞肝癌,目前世界范围都大约有1.7亿人口感染了HCV[1],由于其高流行性、隐匿的病程和持续感染的诊断不足使得其成为严重的医学和社会经济学问题.病毒基因组约在10a以前就被鉴定出来,并且引起了对HCV基因结构、病毒蛋白结构和生化特征的研究.但由于HCV基因组表现出显著的序列变异,尤其是在E2包膜蛋白编码区的高变区,并且在全球范围内,HCV的基因型多达30个[2].
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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登革4型病毒5'非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用
目的 探讨登革4型病毒5'非编码区SLB元件对病毒复制和翻译的调控作用.方法 首先通过mfold 3.2软件对登革4型病毒5'端RNA二级结构进行预测,确定了3个突变位点:SLB1,缺失位于短茎环82-87位5'UAR环化序列,并破坏其保守茎环结构;SLB2,在次环引入突变破坏其环状结构(M77 G/C);SLB3,突变仅涉及核苷酸,不破坏该次环二级结构(M77-78AG/GA).然后在含有海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建上述突变体.将突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因技术和实时定量RT-FCR对突变体的复制和翻译水平进行检测.结果 SLB1突变体的翻译水平并未受到显著影响,但其复制水平出现显著下调.SLB2突变体的翻译水平亦未受到显著影响,但其复制水平受到完全抑制;SLB3突变体的复制和翻译水平均受到了完全抑制.结论 登革4型病毒5'非编码区SLB元件对基因组RNA复制和翻译具有重要的调控作用.
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双荧光素酶标记丙型肝炎病毒亚基因组复制子细胞模型的建立
目的 构建双荧光素酶标记丙型肝炎病毒(HCV)亚基因组复制子细胞模型,为HCV研究提供有效工具.方法 通过单克隆筛选及慢病毒感染构建双荧光素酶标记的HCV亚基因组复制子细胞模型(HCV Fluc-Ubi-Gluc).利用荧光素酶检测、Western印迹检测鉴定细胞模型,利用IFN-α对HCV抗病毒效果评价验证细胞模型的有效性.结果 筛选所得HCV亚基因组细胞克隆检测到荧光素酶活性,Western 印迹检测到HCV NS5A蛋白表达.NS3/4A对黄色荧光蛋白(YFP)标记的MAVS(YFP-MAVS)切割作用使亚细胞定位发生转移.IFN-α处理后荧光素酶活性、HCV蛋白表达水平明显降低.结论 该模型采用萤火虫荧光素酶报告基因指示HCV亚基因组在细胞内的复制水平,Gaussia荧光素酶指示细胞的生长数量,能准确反映候选药物对HCV复制水平的影响,并有效排除药物的细胞毒性干扰,具有操作简单、快速等优点,在抗病毒药物高通量筛选、HCV致病机制等研究方面具有一定的价值.
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登革4型病毒基因组cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用
目的:探讨登革4型病毒C基因中保守的cHP发卡结构对病毒复制和翻译的调控作用.方法:首先在获得含有海肾荧光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP)基础上,利用重叠PCR构建cHP发卡结构系列突变体(cHP1～cHP6).将构建的突变体(包括相关的阳性和阴性对照复制子)分别线性化并体外转录成RNA后,取等量各转录体RNA,以脂质体法分别转染BHK-21细胞.通过间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR、R.luc报告基因检测技术和实时定量RT-PCR对突变体的复制和翻译进行检测.结果:cHP发卡结构系列突变体均可在BHK-21细胞中复制并稳定表达病毒特异蛋白,在该发卡结构中引入缺失或突变对病毒早期翻译并无显著影响,但病毒RNA复制均显著下调.结论:cHP发卡结构在基因组RNA复制过程中可能具有重要的调控作用.
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含有海肾萤光素酶报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子的构建
目的:构建含有海肾萤光素酶(Renilla luciferase, R.luc)报告基因的登革4型病毒亚基因组复制子,为探讨病毒基因组中保守序列和元件在复制和翻译调控机制中的作用提供新的手段.方法:利用定点诱变PCR技术构建prM-E基因缺失的登革4型病毒亚基因组复制子(DENRP),用顺式水解酶元件(cis-acting hydrolase element,CHYSEL)技术将R.luc报告基因插入到DENRP缺失的结构基因区,构建含有R.luc报告基因的复制子(DEN-R.luc2A-RP).将构建的复制子线性化并体外转录成RNA后,经电穿孔转染BHK-21细胞,通过间接免疫荧光、RT-PCR和R.luc检测技术对复制子进行鉴定.结果:所构建的prM-E基因缺失的复制子和含有海肾萤光素酶报告基因的复制子,均可在BHK-21细胞中自主复制并稳定表达病毒特异蛋白.DEN-R.luc2A-RP可持续表达外源R.luc报告基因21 d,在转染后24~96 h R.luc荧光信号呈线性增强.在该区间进行实时检测可显示复制子复制和翻译水平的变化.结论:获得了两株可在BHK-21细胞中稳定表达的复制子,为进一步研究登革4型病毒复制和翻译机制奠定了基础.
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登革病毒C基因突变对病毒RNA复制的影响
目的:分析C基因及其编码蛋白突变对登革病毒RNA复制的影响.方法:利用融合PCR方法在登革病毒复制子中引入C基因相应部位的缺失突变,将复制子RNA转染细胞后,利用报告基因活性分析、间接免疫荧光及实时定量PCR等方法分析其复制水平.结果:获得了含有不同α螺旋缺失突变的C基因的复制子质粒,并发现△α1复制子复制水平明显下降.结论:登革病毒C蛋白α1螺旋或其编码序列对病毒RNA复制具有重要作用.
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炭疽保护性抗原第四结构域基因在重组SFV复制子载体中的表达
目的:构建炭疽毒素保护性抗原第四结构域PA4基因的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus, SFV)复制子载体,并观察PA4抗原在重组SFV复制子载体中的表达.方法:将PA4基因克隆到基于RNA和DNA的SFV复制子表达载体中,获得的重组SFV复制子载体直接转染BHK21细胞,通过间接免疫荧光和Western印迹试验检测PA4在细胞中的表达;与辅助病毒载体共转染制备重组病毒颗粒,通过间接免疫荧光和Western印迹检测PA4在重组病毒颗粒感染细胞中的表达.结果与结论:成功地构建了基于RNA和DNA的PA4重组SFV复制子载体,并且在体外基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体能够在细胞中有效地表达非分泌型和分泌型的PA4抗原,制备了具有感染能力并能表达PA4抗原的重组病毒颗粒,为进一步以SFV复制子作疫苗载体观察炭疽新型复制子疫苗的免疫原性奠定了基础.
关键词： Semliki森林病毒 复制子 炭疽毒素 保护性抗原 重组病毒颗粒 -
西尼罗病毒RNA复制子系统的建立与应用
目的 构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子.方法 在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3'UTR端引入Pac Ⅰ酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep.同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和海肾荧光素酶(R.luc)报告基因分别插入上述复制子质粒中,获得含有报告基因的复制子pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.hc.将上述克隆线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,观察不同时间点绿色荧光蛋白(GFP)的活性和R.luc活性.结果与结论 获得了WNV复制子pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc,酶切和测序鉴定结果显示,序列与预期一致.将含有报告基因的复制子转染细胞72 h后仍能观察到荧光信号,R.luc的活性随时间延长而增强.本研究成功构建了WNV Chin-01株的RNA复制子,该复制子能够在哺乳动物细胞中有效复制并表达外源蛋白,为下一步构建WNV单轮感染病毒样颗粒奠定了基础.
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复制型DNA疫苗的研究进展
复制型DNA疫苗是基于常规DNA疫苗和RNA复制子疫苗的基础上发展起来的一种新型疫苗,既具有稳定性好、安全性高的优点,又实现了外源基因的高效表达.本文就复制型DNA疫苗的构建、作用机制、优点以及新的研究进展作一简要综述.
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干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用
目的利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞模型,体外研究干扰素α(IFN-α)对HCV复制子的抑制作用,并探讨 IFN-α信号传导与激活转录分子( STAT )及介导 IFN-α抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)的表达水平.方法以HCV复制子质粒为模板体外转录合成HCV复制子RNA, 将此RNA 转染Huh7肝癌细胞并经G418筛选,建立HCV复制子细胞株;用不同剂量(0～5000 IU/ml) IFN-α处理HCV复制子细胞72 h或用1000 IU/ml IFN-α处理细胞不同时间(0、 24、 48、 72、 96h),通过半定量RT-PCR及实时定量PCR同时检测HCV RNA,Western印迹检测HCV NS5A蛋白表达水平,研究IFN-α对HCV复制子的抑制作用.结果 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,10 IU/ml 及25 IU/ml IFN-α可使HCV RNA较无IFN-α处理的对照细胞分别降低约68%及75%;IFN-α 1000 IU/ml作用24 h或96 h导致HCV RNA较对照组分别降低75%及88%,同样,IFN-α对HCV NS5A蛋白的合成也有明显抑制作用,说明IFN-α的抗HCV作用呈剂量及时间依赖性;HCV复制子细胞中有抗病毒作用的 ISG(PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ)呈明显的IFN诱导性表达.结论 IFN-α能明显抑制HCV RNA的复制,其抑制作用与IFN-α剂量及作用时间有关,PKR、2'5'OAS、G1P3、ISG20及ISGF3γ等ISG可能介导IFN-α的抗HCV作用.
