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携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制
我们以体外能够表达野生HBV的质粒pHBV3091为研究对象,用GFP基因替代HBV的S读码框构建携带外源基因的重组HBV载体pHBV-S-GFP.为了保证重组载体中外源基因能够有效表达及整个HBV基因读码框的顺利通读,在改造HBV时保留了S基因的前9个核苷酸使GFP与之融合,从而保证S基因起始密码子附近的DNA结构尽可能与野生HBV一致,保持HBV自身基因表达调控元件的特性.
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CD80作为分子佐剂增强HPV11 E7免疫效果的观察
构建的人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)11型E7基因DNA真核表达质粒,在真核细胞获得有效表达.为增强其作为尖锐湿疣治疗性疫苗的免疫效果,现将E7基因与协同刺激分子CD80(所-1)进行连接重组,构建HPV11E7-CD80嵌合DNA真核表达质粒,并将其免疫小鼠,研究其诱导的免疫效应.
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鼠CD40配体基因的克隆及表达
目的:克隆和在真核细胞中表达鼠CD40配体(mCD40L)基因,为进一步研究打下基础.方法:用RT-PCR法扩增mCD40L基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,重组质粒用脂质体转染H22细胞,G418筛选抗性细胞,用RT-PCR检测目的基因的插入,间接免疫荧光检测目的基因的表达.结果:含mCD40L基因重组表达质粒用酶切分析和序列测定进行鉴定后,转染H22细胞经G418筛选获得抗性细胞,经RT-PCR鉴定有含目的基因,间接免疫荧光鉴定有mCD40L的表达.结论:成功克隆mCD40 L基因并在真核细胞得到有效表达.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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IRES特异性IRNA对HCV IRES启动蛋白翻译细胞内抑制作用
目的:研究核糖体内部进入位点(internal ribosome entry site,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitor RNA,IRNA)细胞内对丙型肝炎病毒(HCV)IRES介导蛋白翻译的抑制作用.方法:体外应用脂质体细胞转染法,将IRNA及其突变体mIRNA真核表达载体pcRz-IRNA/pcRz-mIRNA转染人肝癌细胞株(HHCC),经G418筛选4 wk后建立IRNA及mRRNA表达株;以相同的方法构建pcHCVcluc转染株;以脂质体介导细胞转染法将pCMVNCRLuc转染IRNA及mIRNA细胞株,于转染后48 h检测荧光素酶表达量;将IRNA及mIRNA真核表达体转染pcHCVcLuc表达株,于转染后不同时间检测荧光素酶表达量.结果:HCVIRES介导蛋白翻译在IRNA表达株明显受到抑制,同样IRNA对HCV翻译复制子的蛋白翻译作用有明显抑制性;突变体mIRNA表达株和空载体对照株中未见相似的抑制性.结论:pcHCVcluc在HHCC细胞中获得有效表达;IRES特异性IRNA能有效的抑制HCVIRES介导细胞内蛋白翻译作用.
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丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
目的:探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.方法:应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCRluc)转染的抑制作用.结果:G418 筛选能使 Rz213 在转染细胞内有效表达 RzRNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.结论:我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
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人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:构建含人CD81基因的真核表达载体,探讨CD81在COS-7细胞的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81相互作用奠定基础.方法:从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T-CD81,应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAX1;通过脂质体介导的基因转染技术将pVAX1-CD81和空载体转入COS-7细胞;应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物.结果:重组的含CD81基因的真核表达载体pVAX1-CD81经酶切和PCR鉴定分析正确,并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白.结论:成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAX1-CD81,并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子,该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.
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HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达
目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达.方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlappingextension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞.结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,证明连接正确;经间接免疫荧光检测正实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白.结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性生免疫治疗提供了实验依据.
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辨析生殖细胞基因治疗中的两类伦理问题
1 引言基因治疗(gene therapy)是通过基因转移技术将外源正常基因(治疗基因)导入到病变部位的特定细胞(靶细胞)并有效表达,以纠正或补偿基因缺失或异常,从而达到治疗疾病的目的的一种新型疗法.它分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗.
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改良冷配 Schiff 染液在肾穿刺活检病理检查中的应用
肾活检穿刺术是在彩超引导下经皮肾脏组织穿刺,以了解肾脏组织形态学改变,为临床医生判断病情、治疗疾病和估计预后方面提供了重要的依据,肾脏病理检查结果已经成为肾脏疾病诊断的重要方法之一。过碘酸-雪夫氏(Periodic Acid-Schiff stain, PAS)染色是肾穿刺活检术中重要的染色方法之一,主要检测肾脏组织中糖元和其它多糖物质,显示肾小球系膜区的范围和基膜的厚度、肾小球内某些渗出性蛋白、节段性硬化和结节性病灶等[1]。Schiff 液是PAS 染色的主要试剂成分,由于肾脏病理切片厚度为1-2μm,较其他常规切片组织薄,着色相对困难, Schiff 液存放时间稍久,其与肾脏组织糖类物质着色能力下降,给临床诊断造成一定的困难。为此笔者从2010年起,经历了1134例肾穿刺组织染色的摸索,改良了 Schiff 染液的配方,并将该配方与国内传统配方的染色效果进行对比,认为改良冷配 Schiff 染液法有更好的应用效果,不仅缩短 PAS 染色时间,同时也保证肾脏组织糖类物质有效表达,满足肾脏组织中糖类物质定性和定量检测的需要。
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068重组葡萄球菌株诱生白喉抗毒素
以非致病性菌株表达目的抗原,可望诱导有效的免疫应答,其中以革兰阳性的木糖葡萄球菌、肉质葡萄球菌尤为安全、高效.它们与金黄色葡萄球菌有低水平的DNA同源性,但却不产生有致病力的毒素、溶血素、凝集素、蛋白A等,可作为抗原的活载体,有效表达全部或部分抗原成分,诱导持久的体液免疫反应.本实验旨在研究毒性蛋白上某一定义完整的结构域能否被表达在这两种菌株表面,它们能否在小鼠体内诱生中和抗体.已知,白喉毒素(DT)的382~535氨基酸片段是结构完整的区域,为受体结合域DTR.
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肝豆状核变性诊断治疗研究进展
一、病因与发病机制肝豆状核变性(Wilson,s Disease,Wilson病)是一种常染色体隐性遗传病,因某些基因突变不能有效表达基因产物导致铜代谢障碍,使铜过量积聚于肝脏、肾脏、角膜等组织,过量的铜沉积对组织具有毒性作用,引起病变.临床表现主要为:肝脏和神经、精神症状、角膜色素环等.
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贝氏柯克斯体表面抗原基因p1与hspB的融合基因在大肠杆菌中的表达
将贝氏柯克斯体(Coxiella burneil)表面抗原P1蛋白基因与热休克蛋白B(HspB)基因片段融合,并使该融合基因在大肠杆菌细胞内表达,产生P1-HspB融合蛋白.采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增P1蛋白基因(p1)和HspB蛋白基因(hspB)片段,将两基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,分别构建重组表达质粒pQE30/p1和pQE30/hspB.用BamHⅠ和SadI DNA内切酶将p1基因片段从pQE30/p1切下并与pQE30/hspB的hspB连接,构建重组质粒pQE30/p1-hspB.用IPTG诱导pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达融合基因p1-hspB.SDS-PAGE分析发现pQE30/p1-hspB转化的大肠杆菌表达一83 kDa融合蛋白;经薄层扫描分析,该融合蛋白约占到全菌体蛋白的12.1%;免疫印迹分析发现该融合蛋白能被贝氏柯克斯体感染小鼠血清所识别.构建的p1-hspB融合基因在大肠杆菌中得到了有效表达,表达的P1-HspB融合蛋白能与抗贝氏柯克斯体抗体特异反应,P1-HspB融合蛋白为Q热亚单位疫苗的研制提供了一种新型融合蛋白.
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2型重组腺相关病毒/增强型绿色荧光蛋白转染胰腺癌细胞PANC-1的体外研究
基因治疗的关键是目的基因的高效转染和表达.我们采用2型重组腺相关病毒(rAAV2/EGFP)对人胰腺癌细胞PANC-1进行体外基因转移,观察EGFP基因能否在PANC-1中有效表达及其细胞毒性,探讨rAAV2介导目的基因转导胰腺癌细胞的效率.
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大鼠β-防御素-2重组质粒的构建及转染表达
目的:为开展防御素基因转基因以增强粘膜抗感染能力的实验研究,本实验构建真核重组表达载体pBK-CMV-rBD2以进行COS-7细胞转染表达实验.方法:用RT-PCR法(引物含有EcoRI、HindⅢ酶切位点)从肺组织总RNA中扩增出rBD2基因全长cDNA片段,并克隆于pBK-CMV.通过脂质体转染法将pBK-CMV-rBD2导入COS-7细胞,采用RT-PCR法和琼脂糖弥散法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测rBD2的表达及活性.结果:所构建的真核表达重组载体pBK-CMV-rBD2转染COS-7细胞后呈现有效表达并具有活性.结论:提示通过基因转染的方法把防御素基因导入宿主细胞可能增强宿主粘膜抗感染能力,进一步的整体动物转基因抗感染实验研究具有可行性.
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从心理学角度加强医护人员医患沟通能力的再教育
近年来,随着患者及家属法律意识的增强,医患纠纷和诉讼呈逐年增加趋势,其原因除医疗技术和体制等因素外,医患沟通不良是患方对医护人员抱怨和渎职主张的重要原因.而医患沟通质量与患者就医心理和医护人员综合素质密切相关.良好的医患关系有助于双方达成理解,有效表达意愿和要求,改善治疗结局.但是,目前医患沟通的重要性尚未引起医疗机构及院校的足够重视,大多数医学院校未设置相关课程,各级医院对医护人员的再教育也不包含医患沟通的相关培训.
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C端带cmyc和多聚组氨酸双标记的重组人β防御素-2真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的转染表达
目的:人类β-防御素(β-defensins hBDs)是一类具广谱抗微生物活性的小分子阳离子多肽,在人体多种器官尤其是粘膜上皮细胞中广泛存在,起着重要的屏障防御作用.由于Hbd-2在粘膜上皮组织受炎症刺激呈诱导性表达,提示其在机体粘膜防御中的作用更为突出.本研究旨在探索建立不仅能有效表达和分泌人类β-防御素-2而且其表达产物易于被检测和分离纯化的哺乳类动物型工程细胞的可能性及技术路线.
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重组人beta防御素基因在COS-7细胞的转染表达
为探索建立持续稳定表达hBD-2的哺乳类动物型工程细胞的可能性,本研究构建真核重组表达载体pCMV.tag2B/hBD-2以进行COS-7细胞转染表达实验.将本室克隆获得的hBD-2全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV.tag2B构建出hBD-2的重组表达裁体pCMV.tag2B/hBD-2,并经DNA顺序证明hBD-2 cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的硷基组成顺序均准确无误.通过脂质体转染法将pCMV.tag2B/hBD-2导入COS-7细胞.RT-PCR法和免疫印迹法分别从mRNA水平和蛋白质水平检测到被转染的COS-7细胞系能有效表达hBD-2.
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心血管疾病基因治疗研究概况
基因治疗即通过转移并使某些特定基因有效表达,以减轻某一疾病的基础结果,它包括各种技术用于一个共同的目的[1],这些都需要利用分子技术,以使转移的基因能高效、长期及定位地表达.同时,还要确定候选基因在实验模型系统中的潜在治疗价值.虽然基因治疗对心血管疾病的治疗将是革命性的,但目前在临床上还没有基因治疗心血管疾病靶位实际应用的例子[2].