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抗HBcAg人源性单链抗体细胞内表达及其抗病毒复制的实验研究
应用人源性抗HBcAg单链抗体细胞内表达技术,探讨抗HBV复制基因治疗的应用价值.应用噬菌体展示和基因重组技术,从HBV感染的外周血淋巴细胞克隆了人源性抗HBcAg单链抗体,并重组至逆转录病毒载体.以人肝癌细胞smmc-7721和PLC/PRF/5为靶细胞进行基因共转染,分别测定实验组细胞上清中的HBsAg和HBeAg,与对照组做比较,观察抗HBcAg单链抗体细胞内表达的抗病毒治疗作用.结果显示,在急性HBV感染的细胞株中,抑制病毒复制效率为49%～61%,在慢性病毒感染细胞,抑制率为41%～54%.实验结果表明,应用单链抗体细胞内表达技术,在抗病毒治疗研究中具有潜在的应用价值.应对HBV的4个开放阅读框架编码产物进行全面的对比研究,以发现抑制效率高、实用价值大的靶基因.
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人免疫缺陷病毒1型Rev单链抗体细胞内免疫抗病毒基因治疗研究
应用抗HIV-1 Rev单链抗体细胞内免疫方法,研究在人T细胞和周围血淋巴单核细胞内抗病毒复制的效果,探讨细胞内免疫抗HIV-1基因治疗的可行性.克隆抗HIV-1Rev单链抗体(sFv)基因,以逆转录病毒为基因载体,将包装后的含靶基因的逆转录病毒转导至人CD4阳性T-细胞株CEM和SupT1,以及HIV-1阴性自愿者的周围血淋巴单核细胞(PBMC),再分别用不同剂量(MOI)的HIV-1病毒株PNL4-3和HxB2进行病毒攻击实验.测定HIV-1 p24抗原.滴度以了解抗病毒复制的效果,检测带报道基因CAT以了解靶基因在细胞内的表达状况.分别应用0.24、0.06和0.024MOI的PNL4-3或HxB2病毒株攻击,测定p24抗原.结果显示,抗Rev sFv细胞内表达能有效地抑制病毒在细胞内的复制,与对照组比较,病毒复制被抑制效率达90%以上.体外培养细胞2个月,仍可观察到效果,病毒攻击后合胞体细胞形成显著减少.CAT实验表明,逆转录病毒载体可使靶基因在人T细胞和PBMC内有效表达.抗HIV-1 Rev sFv细胞内表达可有效地抑制病毒复制,有望成为抗HIV-1基因治疗的一种手段.
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登革病毒在白纹伊蚊细胞内免疫的研究
目的研究白纹伊蚊对登革病毒产生细胞内免疫现象的分子机制. 方法扩增与克隆登革病毒NGC株的前膜蛋白基因prM,将prM基因以3种不同表达形式重组入昆虫表达载体pBhspEGFP,以3种重组质粒分别转染白纹伊蚊C6/36细胞,测定转染后的细胞对登革病毒感染的免疫效果. 结果构建了包含prM基因的3种昆虫表达载体,Western blot和荧光显微镜观察证明在C6/36细胞中成功表达了prM-EGFP融合蛋白.MTT实验和空斑形成实验反映了C6/36细胞对登革病毒产生了细胞内免疫. 结论 3种重组质粒均可诱导细胞内免疫现象,说明无论是否表达prM蛋白,只要有prM基因转录就可引起细胞内免疫现象;prM基因正义和反义转录形式均可诱导细胞内免疫;其形成机制可能是通过RNA干扰作用而产生.
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丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
目的:探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.方法:应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCRluc)转染的抑制作用.结果:G418 筛选能使 Rz213 在转染细胞内有效表达 RzRNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.结论:我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
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乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究
目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用.方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因,并构建表达HBcAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg,转染PA317细胞,逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBV DNA.结果:成功筛选出HBcAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因,构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体,转染PA317细胞,在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在,上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天,HBsAg、HBeAg逐渐下降,到14d时HBsAg已变为阴性,DNA定量检测无明显变化.结论:HBcAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用.
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组装抗病毒疗法:抗病毒感染的新策略
组装抗病毒疗法(PATs)是近年来新兴的基于细胞内免疫的抗病毒感染策略.目前PATs已在抗病毒(如小鼠白血病病毒、人乙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒)感染等领域进行了深入研究.本文综述了PATs的发展历程和研究现状,并对现存的问题和应用前景进行了分析和展望.
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肝癌单链抗体研究与导向治疗进展
近年来,随着免疫学和分子生物学的发展,肝癌单链抗体(ScFv)研究取得长足进步.ScFv具有分子小、穿透力强、廓清速度快、异源性低、易于大量生产等优点,能够中和病毒和毒素,进行细胞内免疫和作为导向载体,在肝癌诊断和治疗领域中显示出了巨大的潜力.
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抗汉坦病毒NP抗原细胞内抗体的瞬时表达及活性检测
目的: 在真核细胞中表达抗汉坦病毒NP抗原鼠源性单克隆抗体(mAb) 1A8的scFv, 并检测表达产物的活性.方法: 将真核表达载体1A8-scFv-Cκ/pCI-neo用脂质体转染COS-7细胞, 用间接免疫荧光和免疫共沉淀法检测瞬时表达产物的免疫学活性.结果: 间接免疫荧光的结果表明, 约1%细胞胞质中出现弥散荧光, 在免疫共沉淀/免疫印记中, 表达的抗体片段可与汉坦病毒的NP抗原特异性结合.结论: 细胞内表达的1A8-scFv-Cκ可与NP抗原特异性结合, 为进一步研究细胞内抗体的抗病毒功能奠定基础.
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抗丙型肝炎病毒核酶的细胞内免疫及其意义
目的探讨抗丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz)预先转染的细胞内免疫效应. 方法应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213),通过脂质体介导的基因转 染方法,转染人肝癌细胞(HHCC),经G418筛选转染Rz213的基因克隆,应用luc报告基因的表达活性,观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCR luc)转染的抑制作用. 结果 G418筛选能使Rz213在转染细胞内有效表达Rz RNA,转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染. 结论我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达,预先转染发挥细胞内免疫作用,可防止HCV感染.
