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用显微切割技术和催化信号扩增法检测何杰金病瘤细胞(H/RS)中的人巨细胞病毒
为明确何杰金病(Hodgkin's disease,HD)瘤细胞中是否存在人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染,采用显微切割技术结合PCR方法检测HD组织及其瘤细胞Hodgkin/Reed-Sternberg(H/RS)中的HCMV核酸;采用免疫组织化学催化信号扩增(catalysed signal amplification,CSA)法检测HD中HCMV的立即早期抗原、早期抗原和基质蛋白.结果在54例HD中选取13例HD的H/RS细胞,经显微切割分离后有4例(30.8%)经PCR扩增出HCMV的核酸;54例HD组织中,经PCR检测有10例(18.5%)扩增出HCMV的核酸;CSA染色显示有6例(11.1%)HCMV立即早期抗原和早期抗原(DDG9/CCH2)阳性,5例(9.3%)基质蛋白(AAC10)阳性.对照的17例反应性增生淋巴结中HCMV核酸的PCR检测,以及三种HCMV抗原的CSA检测,均为阴性.表明HD组织的H/RS细胞中存在HCMV核酸和抗原,而反应性增生淋巴结中不存在,提示HCMV可能参与了何杰金病的发病过程.
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人卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤中k-ras基因第12、13密码子突变分析
目的 探讨k-ras基因在卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤发病过程中的作用.方法 选用k-ras基因高频突变区引物1对,对53例卵巢肿瘤(包括15例浆液性典型交界瘤、7例浆液性微乳头型交界瘤、14例浆液性经典型癌、14例黏液性交界瘤、3例黏液性癌)用显微切割方法提取肿瘤细胞DNA,进行聚合酶链反应(PCR),直接测序分析PCR产物.结果 在14例黏液性交界瘤中有3例检测到了k-ras基因突变,在黏液性癌及所有浆液性肿瘤中均未发现k-ras基因突变.结论 k-ras基因突变在卵巢黏液性交界瘤的发生过程中可能有一定作用,在黏液性癌、浆液性交界瘤及经典型癌中的作用尚不明确.
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RNA稳定剂在显微切割抽提组织总RNA中的应用
随着人类基因组计划的完成以及cDNA微阵列等高通量技术的飞速发展,对特定组织细胞基因表达谱的研究,必需获取相应组织细胞的RNA,显微切割为获取特定RNA提供了可靠的工具[1,2].不同于常规RNA抽提技术,显微切割需经过冷冻切片、HE染色和显微镜下切割等众多在常温下操作的步骤,容易引起RNA降解.本研究旨在探讨显微切割时防止RNA降解的佳方法.
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深度可控自动压电显微切割系统
为了从不同组织切片上获取某一特定细胞群或单一细胞进行分析研究,研制深度可控自动压电显微切割系统,以解决手工切割操作时间长、易疲劳、精度低等难题.在对超声振动切割进行理论分析的基础上,采用叠堆压电陶瓷作为振动发生装置.根据图像前后景差来检测跟踪切割针尖的实时位置信息,从而通过标定的X轴坐标的变化判断切割针和被操作物体表面的接触情况来获取深度信息.通过对不同条件下的显微切割实验进行分析,均表明该系统可实现将切割针置于被切割组织深度方向的任意位置;自动完成目标生物组织指定位置任意形状的切割,切割线细可达1.5 μm,理论上切割分辨率为50 nm,切割误差0.5 μm,可实现单细胞切割,并能自动实现目标组织切片的分离.明显提高显微切割操作的自动化程度和精度,证明该系统的优越性.
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黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤及其转化细胞的克隆性
目的 分析黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)中转化与未转化肿瘤细胞间的克隆联系.方法 选具有大细胞转化的、可用于激光显微切割的MALT淋巴瘤6例为研究对象,采用EliVisionTM方法检测bcl-10等蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测API2-MALT1融合基因,激光显微切割进行目的细胞群分离,PCR检测免疫球蛋白重链(IgH)基因重排并对产物进行测序分析.结果 伴有转化的6例中1例胞质和胞核同时表达bcl-10蛋白,2例检测出API2-MALT1融合基因.同一例不同肿瘤细胞群分别显示同样的基因重排序列.例2和例5在N区和D区有两个核苷酸位点的碱基不同.结论 伴有转化的6例MALT淋巴瘤转化和未转化肿瘤细胞群均分别来自同一个肿瘤克隆.
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弥漫性大B细胞淋巴瘤t(14;18)易位及bcl-2基因扩增的检测
目的 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)t(14;18)染色体异位及bcl-2基因扩增在其分类及临床分期、疗效评估中的作用.方法 先对60例DLBCL的标本进行显微切割,获取相对比较纯的肿瘤组织,再使用细胞核芯片荧光原位杂交(FISH)对标本进行t(14;18)易位及bcl-2基因扩增检测,采用免疫组织化学SP法在组织微阵列上同步观测CD20、CD10、bcl-6、MUM1的表达,进行生发中心样(GCB)和非生发中心样(non-GCB)分类;通过病例分析得出治疗效果及临床分期的信息,并统计分析以上各因素之间的关系.结果 在60例DLBCL中,10例bcl-2/IgH阳性,18例bcl-2基因扩增;GCB 29例(48.3%),non-GCB 31例(51.7%).经FISH检测t(14;18)阳性10例中,GCB 8例,non-GCB 2例,差异有统计学意义(P=0.031).t(14;18)阳性及bcl-2基因扩增的病例bcl-2表达均增高.在36例正规CHOP治疗的病例中,bcl-2扩增13例,无扩增23例,bcl-2扩增的13例之治疗结果显效、部分有效、无效率分别为3例(23.1%)、4例(30.8%)和6例(46.2%);临床分期情况为Ⅰ～Ⅱ期1例(7.7%),Ⅲ～Ⅳ期12例(92.3%),这两项指标与bcl-2不扩增的相比差异均有统计学意义(P=0.019、0.046).结论 t(14;18)易位及bcl-2基因扩增均是引起DLBCL之bcl-2蛋白表达的原因,bcl-2阳性者与预后有关的原因难以确定,可能是由于引起其阳性表达的原因不同所致;bcl-2基因扩增与治疗效果较差及临床分期较晚有关;FISH检测t(14;18)染色体易位可用于DLBCL的分类.
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新生儿Fc受体在人肾小球肾炎及大鼠肾炎模型中的表达
目的 观察人肾小球肾炎及大鼠肾炎动物模型中,足细胞新生儿Fc受体(FcRn)的表达.方法 (1)收集2009年9月至2010年2月复旦大学医学院病理学系人肾穿刺组织标本39例(包括微小病变病8例、局灶节段性肾小球硬化症4例、IgA肾病12例、膜性肾病9例、狼疮性肾炎6例).透明细胞癌癌旁肾组织5例用作正常对照组.激光捕获显微切割技术分离肾小球,即时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FcRn的mRNA水平,行免疫组织化学(Supervision法)染色观察FcRn在肾小球内表达的定位和强度差异.(2)构建大鼠系膜增生性肾炎(抗Thy1.1肾炎)和大鼠被动型膜性肾病(Heymann肾炎)模型,免疫组织化学(Supervision法)检测FcRn在肾组织内的表达.结果 人肾活检组织中,即时定量RT-PCR显示狼疮性肾炎的FcRn mRNA水平显著高于正常肾组织(P＜0.05)；免疫组织化学结果显示人各型肾炎中FcRn表达阳性率为:狼疮性肾炎6/6,IgA肾病7/12,膜性肾病6/9,均明显高于正常肾组织(0/5,P＜0.05)；微小病变病(1/8)、局灶节段性肾小球硬化症(0/4)与正常组相比差异无统计学意义(P＞0.05).大鼠肾炎模型中,5例抗Thy1.1肾炎中3例、7例Heymann肾炎中2例可见足细胞表达FcRn,5例正常对照中,FcRn均不表达.结论 在免疫复合物介导的人肾小球肾炎和大鼠肾炎模型中,肾小球足细胞FcRn表达上调,FcRn的表达改变可能参与了肾小球肾炎的发生发展.
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激光捕获显微切割细胞的全基因组DNA扩增
组织是多种细胞群体相互作用、相互依存的三维空间结构,这使得在相当长的一段时间内难以准确、深入地从分子水平研究某类特定细胞基因结构和功能的动态变化.肿瘤组织包括瘤细胞、其发源的正常细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种成分.在肿瘤分子病理学和基因组学研究中,排除非肿瘤细胞污染对实验结果的影响尤为重要[1].激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)是在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术[2].它能有效地解除组织中细胞异质性造成的偏差.但从LCM获得的有限细胞中提取的微量DNA难以满足多基因、多位点、多次检测的需求,特别是以DNA芯片为代表的高通量检测的需求.在本研究中,我们通过LCM从癌组织中精确分离目的细胞结合高可信度全基因组扩增技术(high fidelity-whole genome amplification,HF-WGA),建立一种从微量同质细胞中制备足够量基因组DNA用于多次聚合酶链反应(PCR)检测的方法,以提高实验结果的可重复性、可信性、可比性及后续工作的效率.
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胃癌中18号染色体的杂合性丢失研究
目的:检测原发性胃癌组织中18号染色体的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)情况.方法:联合应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)-高可信度全基因组扩增(high fidelity-Whole genomeamplification,HF-WGA)-变性高效液相色谱(denaturedhigh pressure liquid chromatography,DHPLC)方法,检测胃癌中18号染色体上短插入/缺失多态(short insertiondeletion polymorphism,SIDP)标记的LOH.结果:在所检测的10例胃癌组织中3例呈现SIDP位点LOH(30%);9个SIDP位点中3个(MID148、MID150和MID352)发生LOH,其中MID150位点LOH见于3例胃癌组织.在1例胃癌组织中3个SIDP位点同时呈现LOH.结论:联合应用LCM和HF-WGA,经DHPLC分析SIDP标记,可进行肿瘤细胞中LOH检测.本研究为18号染色体上胃癌相关抑癌基因的研究提供一种新技术策略.
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大鼠肺鳞癌癌变过程中INK4a/ARF 基因纯合性缺失的研究
INK4a/ARF基因是一个在人类癌症中(包括肺癌)容易被破坏的基因,它可利用不同的第一个外显子(1α、1β)和下游两个共同的外显子编码两个不同的蛋白,一个是细胞周期素依赖激酶抑制剂p16INK4a;另一个是p19ARF(p19 alternative readin g frame)是一个可以改变的阅读框架,能结合MDM2(murine double minute-2, 小鼠双微 2)并促进MDM2的降解,而稳定野生型p53蛋白,从而使p21上调引起细胞周期阻滞或诱导细胞凋亡.本研究在石蜡切片中利用免疫组化S-P法检测p16INK4a蛋白的表达;利用显微切割和聚合酶链反应(PCR)技术检测INK4a/ARF基因纯合性缺失与大鼠肺鳞癌发生发展的关系.
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环线切割治疗小儿拇指狭窄性腱鞘炎临床观察
目的：探讨环线切割微创技术治疗小儿拇指先天狭窄性腱鞘炎( congenital trigger thumb，CTT )手术效果。方法2013年3月至2014年9月，我科收治小儿拇指 A1滑车 CTT 患儿19例(31侧)，均在超声引导下通过环线切割微创技术进行拇长屈肌腱狭窄腱鞘的松解。对患儿术前、术后进行 Quinnell 分级进行评估，并通过配对t 检验进行统计学分析。结果环线切割微创技术创伤小，出血少，术后无穿刺点感染、愈合不良、血管神经损伤等情况发生，术后患儿均在3～7天内恢复正常手指功能，拇指主、被动伸直活动28侧完全正常，局部无疼痛症状，术后随访12～30个月未见复发。2侧症状有所缓解，仅1侧基本无缓解，治疗有效率96.7%。Quinnell 分级表评分术前3.48±0.54、术后0.39±0.73，术前、术后差异有统计学意义(P＜0.05)。结论环线切割微创技术可作为小儿 CTT 治疗安全、有效的治疗方法。
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表浅性膀胱移行细胞癌生物标记组研究及系统生物学分析
目的 探索Shotgun蛋白质组学方法筛选表浅性膀胱移行细胞癌的生物标记组,并分析肿瘤恶性变过程中的生物通路.方法 使用激光捕获显微切割技术获得纯化的表浅性膀胱肿瘤细胞及正常移行上皮细胞,二维液相色谱电喷雾串联质谱鉴定标本中的蛋白质表达,蛋白质组学工具分析蛋白质的等电点、相对分子质量、总体平均疏水性以及跨膜结构.基因本体论工具对鉴定蛋白质进行功能聚类,ArrayTrack软件分析差异表达的生物通路,GenMAPP软件实现生物通路可视化.结果肿瘤细胞及正常移行上皮细胞中分别鉴定蛋白质440、218个,差异表达蛋白质388个.蛋白质鉴定数据以及功能分析数据分别储存于http://www.Proteome-SBTCC.org.cn;http://www.Proteome-NHTE.org.cn,267个(68.8%)差异表达蛋白质具有生物学途径注解,分别归属于丝裂原活化蛋白激酶、聚合粘附、氧化磷酸化、胞外基质受体相互作用等通路.结论 正常移行上皮细胞及肿瘤细胞Shotgun策略蛋白质组学数据库被成功构建,为阐明表浅性膀胱肿瘤的发生发展机制及寻找生物标记组提供了理论依据.
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结直肠癌相关肿瘤标志物的定量蛋白质组学研究
目的 筛选结直肠癌相关的肿瘤标志物.方法 收集20例结直肠癌组织及配对的正常结肠黏膜上皮组织,分别采用激光捕获显微切割技术切割纯化结直肠癌细胞和正常结肠黏膜上皮细胞;应用基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法分析鉴定结直肠癌和正常结肠黏膜之间差异表达的蛋白质;借助生物信息学工具对差异蛋白进行功能聚类分析.结果 共鉴定得到137个在结直肠癌和正常结肠黏膜之间差异表达的蛋白质,其中67个蛋白在结直肠癌中的表达上调,70个蛋白在结直肠癌中的表达下调.对差异蛋白进行功能通路分析,得到了7个高可信的功能网络,包括细胞生长增殖、氨基酸代谢、炎症反应、胚胎发育、细胞分化、分子转运及细胞骨架的构成.结论 基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法是筛选结直肠癌肿瘤标志物的有效策略.
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颧脂肪垫的解剖学研究与老化分析
目的 通过对颧脂肪垫的解剖学研究,探讨面中部老化机制.方法 选取10具甲醛固定后的成人尸头标本20侧,应用显微手术器械在10倍解剖显微镜下逐层解剖,仔细观察面中部纤维,区分不同区域皮肤与皮下脂肪层的结合方式,对其进行标记,注意其位置及范围,观察脂肪垫的范围、形状、位置,记录支持结构的解剖学位置并照相保存.结果 ①颧脂肪垫近似一个三角形,底部沿下睑眼轮匝肌支持韧带上层呈一弧线；内侧界为鼻唇沟和口下颌沟；外侧界从颧大肌在颧骨表面的止点区到达口角外下方或下颌缘.②颧脂肪垫系由较韧的纤维结缔组织组成的网状结构,其间有较大的脂肪颗粒；沿鼻唇沟水平方向牵拉,使颧脂肪垫纤维更加紧密,垂直方向牵拉,使颧脂肪垫纤维变得疏松,纤维之间距离增大.③在面部皮肤层和颧脂肪垫之间存在4个连接紧密的区域,从内向外分为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区和Ⅳ区,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区为与鼻唇沟平行的长条形,Ⅳ区为不规则的 四边形.④颧脂肪垫与深层组织固定的结构有6条韧带:眼轮匝肌支持韧带上、下层、颧弓韧带、颧骨皮韧带、颧骨下皮韧带、颈阔肌皮肤前韧带、颊上颌韧带.结论 颧脂肪垫与皮肤连接紧密,而与深层组织只有6条韧带相连接,随着时间的推移,颧脂肪垫支持韧带的松弛导致颧脂肪垫随着皮肤的老化下垂而下移,从而形成特征性的衰老面容.
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Aurora-A/STK15在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与预后的关系
目的 探讨Aurora-A/STK15在上皮性卵巢癌组织中的表达变化及其与预后的关系.方法 应用显微切割法从石蜡切片上提取总RNA,实时定量PCR和免疫组化方法检测80例原发性卵巢上皮性癌和29例正常卵巢组织中Aurora-A/STK15 mRNA及蛋白水平的表达,分析其作为卵巢癌标志物的可行性以及与预后的相关性.结果 上皮性卵巢癌组织中Aurora-A/STK15 mRNA的表达明显高于正常卵巢组织[(60.5±74.2)对(2.19±1.4),P<0.01],但mRNA的表达水平与卵巢癌的分期和分级以及生存时间无关,P>0.05;上皮性卵巢癌Aurora-A/STK15蛋白的阳性表达率也明显高于正常卵巢组织(87.3%对6.9%,P<0.05),蛋白表达水平随病理分级和手术分期增加而增加,与病理分级密切相关(P<0.05),而与手术分期的相关性无统计学意义(P>0.05);在行理想肿瘤细胞减灭术并行术后辅助泰素化疗的病例组,Aurora-A/STK15蛋白高表达预后好,总的生存时间较低表达病例生存时间长(P<0.05);在除泰素以外的铂类药物化疗组,Aurora-A/STK15蛋白高表达则与不良预后相关,高表达者总的生存时间短(P<0.05).结论 Aurora-A/STK15在上皮性卵巢癌中存在异常表达,且与卵巢癌的分化程度以及手术联合辅助化疗的预后密切相关,有望成为卵巢癌个体化治疗疗效的预测因子.
关键词： 丝氨酸/苏氨酸激酶15 上皮性卵巢癌 显微切割 组织芯片 -
TLR4/NO通路在高危型HPV阳性的子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义
目的 初步探索Toll样受体(TLR)/NO通路在高危型HPV阳性的子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义.方法 (1)选取2012年11月1日至2013年5月20日在复旦大学附属妇产科医院就诊的高危型HPV阳性的子宫颈鳞癌患者(宫颈癌组)及经病理检查诊断为正常子宫颈的高危型HPV阳性患者(对照组)各36例,Greiss法检测两组患者宫颈管NO含量;免疫组化SP法检测两组患者子宫颈组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达;激光显微切割(LCM)技术获取两组患者子宫颈组织中的鳞状上皮细胞,采用逆转录(RT)-PCR技术检测所获鳞状上皮细胞中TLR/NO通路中关键基因[包括TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、核因子κB(NF-κB)p65、iNOS]mRNA的表达水平;将宫颈癌组和对照组中表达差异为显著的TLR(为TLR4)用于后续研究.(2)选用子宫颈癌细胞系CaSki(HPV 16 阳性)、HeLa(HPV 18阳性)和C33a(HPV阴性),采用RT-PCR技术和蛋白印迹法(western blot)分别检测CaSki、HeLa和C33a细胞中TLR4、NF-κBp65、iNOS mRNA和蛋白的表达,采用细胞免疫荧光法检测CaSki、HeLa和C33a细胞中TLR4蛋白的表达.结果 (1)宫颈癌组宫颈管NO含量为(42.92±0.36) μmol/L,对照组为(15.49±0.24) μmol/L,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).宫颈癌组和对照组子宫颈组织中iNOS蛋白的阳性表达率分别为75％(27/36)、6％ (2/36),两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);iNOS蛋白的表达与子宫颈鳞癌患者年龄、肿瘤大小和临床分期无关(P＞0.05);而与有无淋巴结转移、淋巴血管浸润明显相关(P＜0.05).宫颈癌组子宫颈组织鳞状上皮细胞中TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、NF-κBp65、iNOS mRNA的表达水平分别为4.80±0.32、7.41 ±0.39、2.90±0.14、2.02±0.26、3.09±0.16、2.88±0.17,对照组分别为1.21±0.12、1.86±0.21、1.25±0.11、1.22±0.14、0.48±0.15、0.27±0.11,宫颈癌组均高于对照组,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),其中宫颈癌组与对照组中表达差异为显著者为TLR4;而两组间TLR9 mRNA表达水平(分别为0.79±0.05、0.93±0.07)比较,差异则无统计学意义(P＞0.05).(2) RT-PCR技术和蛋白印迹法检测显示,HeLa和CaSki细胞中TLR4、NF-κBp65和iNOS mRNA和蛋白的表达水平均高于C33a细胞,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).细胞免疫荧光法检测显示,HeLa、CaSki、C33a细胞中TLR4蛋白表达水平(以积分吸光度表示)分别为3 599±427、2080±456、730±96,两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 高危型HPV阳性的子宫颈癌组织和细胞中TLR4/NO通路关键基因表达水平增高,推测TLR4/NO通路激活可能参与了高危型HPV感染所致子宫颈癌的形成过程.
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人胃癌原发灶与淋巴结转移灶的差异蛋白质组学研究
目的：利用比较蛋白质组学技术识别并鉴定胃癌原发灶与淋巴结转移灶中的差异表达蛋白质，筛选特异性的转移相关蛋白，探讨胃癌淋巴结转移的分子机制。方法将前期应用二维差异凝胶电泳技术（DIGE）获取人胃癌原发灶及转移灶差异蛋白表达图谱进行分析获得的11个差异表达蛋白质，运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行鉴定，得到相应的肽质量指纹图（PMF），然后搜索数据库鉴定出部分蛋白质。利用免疫组织化学技术检测HSP 70在胃癌中的表达水平。结果对11个差异蛋白质点进行PMF分析后，通过Mascot软件查询鉴定出其中5个蛋白质点（HSP70的8同种型2变异体、2个伴侣蛋白、亮氨酸氨肽酶、预测假想蛋白XP_515584）。 HSP70、伴侣蛋白、亮氨酸氨肽酶的表达在原发癌灶中明显升高。免疫组织化学检测示HSP 70的表达水平随着胃癌恶性程度的增加及淋巴结的转移逐渐增加，与蛋白质组学的分析结果一致。结论人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱相似，说明两者癌细胞的来源、分化程度相对一致，仅有少数蛋白质的质和量发生了明显变化，参与了淋巴结转移。其涉及细胞生理活动的各方面，与肿瘤的发生、发展等密切相关。 HSP70参与了胃癌的发生发展，其表达水平与胃癌有无淋巴结转移及恶性程度有密切关系。
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人胃腺癌原发灶与转移灶中差异蛋白表达谱的初步研究
目的 利用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术建立分辨率高和重复性好的人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,并分析差异表达蛋白质.方法 收集、筛选6例新鲜的人胃腺癌原发灶组织及转移的淋巴结组织标本进行比较蛋白质组学研究.用非染色冰冻切片显微切割法分别获取人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中的腺癌细胞,裂解后提取蛋白,每例取等量蛋白,任选3例混合,共分成2组.用DIGE染料Cy2、Cy3、Cy5对样品分别标记,然后进行双向电泳,获得人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,后使用Typhoon扫描仪进行图像扫描,用DeCyder-Differential分析软件进行分析,识别两者之间的差异表达蛋白质.结果 应用非染色冰冻切片显微切割法得到较纯的原发灶与淋巴结转移灶中的癌细胞,不会因为染色问题改变蛋白所带电荷引起的2-DE图像模式的改变,提示它是一种低价、简便的样品制备方法之一.对6例胃癌原发灶与淋巴结转移灶的腺癌细胞样本进行二维差异凝胶电泳,建立了分辨率高、重复性好的差异表达图谱.分析显示差异凝胶1、差异凝胶2的蛋白质点分别为1 416个(相似点1 062个,下调点277个,上调点77个)、1 299个(相似点1 050个,下调点157个,上调点92个).运用DeCyder-Differential软件(Biological Variation Analysis version 5.0)对Gel1、Gel2中的蛋白质点进行分析(P=0.05,阈值:＞1.5倍或者＜-1.5倍),获得11个差异表达的蛋白质.结论 非染色冰冻切片显微切割法及DIGE技术是一种简单可行的蛋白质样品纯化方法,建立了分辨率高、重复性好的人胃癌原发灶与淋巴结转移灶中腺癌细胞的差异蛋白表达图谱,为进一步探讨胃癌转移机制、特异性标志物筛选奠定了初步基础.
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染色体分离基因在纯化鼻咽癌组织中的表达
目的 研究染色体分离基因(homosapiens chromosome segregation gene,CSE1L)在纯化鼻咽癌及非癌组织中的表达.方法 首先从全基因组表达谱中筛选到鼻咽癌候选癌基因CSE1L.结合RNA保护、显微切割及线性扩增技术,获得纯化鼻咽组织中反义RNA(antisense RNA,aRNA),采用半定量逆转录聚合酶链式反应(semi-quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction,sqRT-PCR)研究从全基因组表达谱中筛选的候选癌基因-CSE1L在两种不同纯化鼻咽组织aRNA中的表达.结果 在纯化鼻咽癌组织和鼻咽部非癌组织全基因组表达谱中,CSE1L基因表达值分别为1.056±0.296和0.465±0.835,相差2.27倍,两组比较有显著性差异(df=16,t=4.317,P=0.001＜0.01).sqRT-PCR检测纯化鼻咽癌组织及非癌组织aRNA中CSE1L基因的表达,分别为1.740±1.105和0.618±0.183,两组比较有显著性差异(df=30,t=3.159,P=0.004＜0.01).结论 利用全基因组芯片构建基因表达谱可筛选到鼻咽癌发病相关的候选靶基因,sqRT-PCR可验证芯片杂交结果,CSE1L基因是鼻咽癌发生、发展过程中重要的候选癌基因.
关键词： 鼻咽肿瘤 显微切割 芯片分析技术 染色体分离 逆转录聚合酶链式反应 -
小型猪Barx1基因的克隆及其在牙胚中的定量表达
目的 观察小型猪牙齿发育相关基因Barx1片段在胚胎发育40 d(E40)不同牙胚中的定量表达,探讨Barx1基因空间表达量与牙齿形态的关系.方法 应用基因克隆技术克隆小型猪Barx1基因片段；应用激光捕获显微切割技术精确分离胚胎40 d小型猪第一乳切牙、乳尖牙、第三乳前磨牙、乳磨牙牙胚；提取微量RNA,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为对照,通过实时定量聚合酶链反应检测Barx1的相对表达量.结果 得到小型猪Barx1基因698个碱基的片段,Barx1在第一乳切牙、乳尖牙、第三乳前磨牙、乳磨牙中的相对表达量为0.000 249、0.000 715、0.026 096、0.1 12 656,在牙弓中由前向后呈递增趋势.结论 Barx1基因表达量与牙齿形态发育存在一定关系,推测小型猪Barx1基因可能与牙尖的分化或牙尖数目相关.
