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外周血B淋巴细胞半套式PCR法扩增人抗体基因
目的用半套式PCR法,以一组人抗体重链和轻链引物直接从人外周血淋巴细胞中扩增人全套抗体基因片段.方法从不同人群外周血淋巴细胞中提取总RNA,经反转录后,以免疫球蛋白信号肽序列引物和家族特异性免疫球蛋白可变区基因引物,进行半套式PCR扩增人全套抗体基因片段.结果采用不同的引物进行重链、轻链Kappa和Lambda链的半套式PCR扩增,均能获得相应大小的PCR产物,其结果扩增率达到100%.结论在建立抗体基因文库时,半套式PCR法能进一步丰富扩增的抗体基因的多样性,可弥补由于转化效率不高而降低抗体库多样性的不足.
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特异性嵌合抗原受体的T细胞肿瘤免疫治疗相关专利申请状况分析与研发进展
1989年,Eshhar研究小组首次提出将针对肿瘤抗原单克隆抗体的可变区和T细胞受体(T cell receptor,TCR)的亚基融为一体,重定向T细胞的免疫反应.表达特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原,启动并活化下游级联反应,特异性杀伤肿瘤[1].这一尝试开启了嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T immunotherapy)的序幕.该疗法的一般程序是将患者的免疫T细胞在体外通过生物技术改造,采用B细胞的抗体基因和T细胞表面受体基因结合,用载体导入患者的免疫T细胞,从而使T细胞具有靶向性,令其识别肿瘤细胞表面的抗原,然后把T细胞输回给患者,达到识别、杀死肿瘤细胞的治疗效果.
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利用单个B细胞分选方法获得HIV-1单克隆抗体基因及功能鉴定
目的 从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定.方法 单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Matrix程序分析基因序列一致性,免疫遗传学数据库分析抗体基因家系和突变率,酶联免疫吸附试验测定抗体结合能力,TZM-bl/假病毒试验检测抗体中和能力.结果 从3个HIV-1感染者中分别获得了4个、7个和11个不同抗体的重链和轻链基因序列,其基因家系、CDR3长度和突变率广泛多样;验证了一个感染者的4个抗体基因序列,抗体A1和B3是HIV-1单克隆结合抗体,能同时与B亚型、CRF01 AE和CRF07 BC抗原蛋白结合;A1和B3也是HIV-1单克隆中和抗体,能够中和C亚型的MW965病毒,50%抑制浓度分别为0.04μg/ml和37.34μg/ml.结论 本研究成功获得了大量的单克隆抗体基因,并对其中的部分序列进行了功能验证,为单克隆抗体的分离和鉴定等研究工作提供了基础.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究
目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用.方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因,并构建表达HBcAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg,转染PA317细胞,逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBV DNA.结果:成功筛选出HBcAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因,构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体,转染PA317细胞,在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在,上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天,HBsAg、HBeAg逐渐下降,到14d时HBsAg已变为阴性,DNA定量检测无明显变化.结论:HBcAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用.
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单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用
抗原刺激动物免疫系统产生抗体,抗体识别抗原的部位在其重链和轻链的可变区(variable region).如果将抗体的可变区(VH和VL)通过弹性多肽接头(peptide linker)稳定地连接在一起,即为单链抗体(single chain fragments variable,scFv).scFv大小仅为完整抗体的1/6,但其完全保持了抗体的抗原特异性及抗原的结合能力,同时由于为单链,在大肠杆菌或植物体内等容易表达,无须组装即能保持活性.在植物研究领域,其可用于植物病理诊断、植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制;而将单链抗体基因转入植物细胞,更可使转基因植物获得诸如增强对病毒、除草剂等的抗性,体内生理活性物质增加,次生代谢产物量提高等新的特性.特别是通过转入单链抗体基因,提高药用植物中具生物活性的次生代谢产物量的技术,可望发展成为一种新的分子育种方法,可以在不需要明了目标成分的生物合成途径的情况下,提高其产量.
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应用PCR从丙型肝炎患者外周血B淋巴细胞扩增抗体基因
用常规RTPCR法,以1组人抗体重链和轻链简并引物,直接从5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增出抗体重链Fd基因和κ轻链基因.结果提示,用Trizol试剂提取细胞总RNA,以Olig(dT)引导合成cDNA第一链,再经PCR扩增的方法,是值得优先采用的方法.细胞总RNA的提取不必追求高纯度,少量外周血即足以满足构建抗体库所需,简并引物可获得良好的扩增效果,为构建噬菌体抗体库奠定了基础.
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RT-PCR扩增人抗HBsAg抗体Fab段基因
目的采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从少量外周血中扩增抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。方法 用RNAex试剂提取细胞总RNA,以Olig(dT)引导合成cDNA第一链,再经PCR扩增的方法,以重链Fd和κ轻链基因简并引物,直接从人外周血混合淋巴细胞中扩增出抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结果 扩增出分子量为700 bp的抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结论 得到的抗体基因为下一步构建含人抗HBsAg抗体Fab段基因的腺相关病毒载体奠定了基础.
关键词: 逆转录-聚合酶链反应 抗体基因 HBsAg -
9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3分 子表达的抑制作用
[欧阳为明,金伯泉,夏海滨,刘 飞,李德敏,张建平. 中华微生物学和免疫学 杂志,2001;21(1):58-61] 目的 获得9.1C3胞内抗体基因的真核表达载体,观察胞内抗体对9.1C3分子表 达的抑制作 用,为进一步研究9.1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础. 方法 设计引 物,以9.1C3 ScF v基因为模板进行PCR扩增,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标 记的Etag序列. 回收纯化PCR产物,酶切后连接到pUC19载体上,并进行序列测定. 序列正确 后 切下胞内抗体基因片段,重组到真核表达载体pRc/CMV中,酶切鉴定后用DEAE-dextran方法 瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Westem blot 方法检测胞内抗体的表达. 接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9.1C3阳性的Jurkat细 胞,用FCM观察胞内抗体对9.1C3分子表达的影响. 结果 DNA序列测定证明 ,通过PCR成功地 为9.1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E-tag序列,成功地构建了胞内抗体 真核表达载体,通过胞内染色方法和Westem blot证明胞内抗体在COS7中得到表达. 转入Jur kat细胞后发现胞内抗体能下调9.1C3分子的表达水平. 结论 以9.1C3 ScF v基因为模板PCR扩增得到9.1C3胞内抗体基因,并构建了真核表达载体.(井晓梅)
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人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆
目的扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T载体来构建T载体文库.方法收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA,行RT-PCR扩增,制备T载体,用于PCR产物的克隆.结果总RNA纯度高,完整性好,mRNA获得率为1%.经RT-PCR,VH、Vλ、Vκ的每一条5'端引物均与其相应的3'端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T载体库分别为1.7×108和3.5×108.结论所采用的引物能够100%扩增目的片段,T载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础.