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利用B细胞培养和RT-PCR技术从我国HIV-1感染者中筛选膜蛋白特异性单克隆抗体的初步研究
本研究通过采集1型人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者抗凝全血,分离出外周血单个核细胞,然后用磁珠分选纯化记忆性B细胞和体外活化记忆性B细胞,促使其分泌抗体,用ELISA法识别阳性B细胞克隆,并提取阳性B细胞的RNA,从中扩增抗体重链和轻链基因并克隆到表达载体中,再用携带重链基因的质粒和携带轻链基因的质粒共转染293T细胞,获得HIV-1特异性人单克隆抗体,进行抗体特性的鉴定.结果从1例HIV-1感染者的记忆性B细胞中筛选出了4株HIV-1包膜糖蛋白(Envelope glycoprotein,Env)特异性人单克隆抗体,其中2株具有较好的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用活性,另有1株对HIV-1假病毒有较弱的中和活性.说明我们成功地引进了利用B细胞培养和RT-PCR技术从人体淋巴细胞中筛选特异性抗体基因的人单克隆抗体技术平台.用该技术可以成功获得HIV-1 Env特异性单克隆抗体,为将来从能产生高滴度广谱中和抗体的感染者体内筛选广谱中和抗体打下了基础.
关键词： 人类免疫缺陷病毒 单克隆抗体 中和活性 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 -
戊型肝炎病毒高通量中和效价评价模型的建立
广泛有效的体外感染模型的缺乏限制了抗戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体及血清定量化中和效价的评估,从而阻碍了对HEV相关抗体应答及免疫机制的深入研究.本研究首先通过在HEV低效复制细胞系HepG2肝癌细胞株上进行了HEV感染细胞后的连续监测,直到第13d到达病毒载量的检测下限,验证了该细胞系建立感染模型的可行性,进一步采用96孔多通道平行感染、核酸提取及实时荧光定量PCR对五株抗HEV的鼠源单克隆抗体及四位戊肝疫苗接种者的接种前、后血清样本进行了细胞中和试验.结果显示应用该模型能够实现对不同中和能力的单抗及接种疫苗前后的血清进行中和效价的定量化评估.表明本研究已成功建立了HEV体外高通量中和评价模型,同时也显示出该模型在HEV疫苗及抗体应答表位研究中所具有的潜在价值.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 细胞模型 评价 中和活性 高通量 -
HIV-1包膜蛋白2G12和2F5中和表位的改造对假病毒形成及中和活性的影响
目的 研究HIV-1膜蛋白(Env)特定中和表位的改造对功能性假病毒形成及中和活性的影响.方法 采用环形诱变及Dpn I筛选的方法对Env进行定点突变,将2G12和2F5两个中和表位整合入不含该表位的BC亚型的Env上,比较改造对假病毒的形成情况及对2G12和2F5单抗的中和活性的影响.结果 对5株假病毒(BC02、BE03、BC04、BC05和BC12)的Env特定中和表位进行改造,其中BC04和BCl2的2G12表位改造后,不能形成假病毒,BC02、BC03和BC05增加2G12和2F5两个表位后,仍能够形成假病毒,且假病毒滴度较改造前无明显变化,改造后的BC03假病毒较改造前对单抗2G12和2175的中和活性均有所提高,而改造后的BE02和BC05假病毒较改造前对单抗2F5的中和活性增强,而对单抗2G12的中和活性无变化.结论 2G12中和表位部分位点的改造影响假病毒的形成,中和表位的增加能够提高单抗2G12的中和活性,为免疫原的优化提供了新思路.
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HCV CE2融合蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
HCV的E2蛋白能刺激机体产生具有中和活性的抗体,其C蛋白序列在不同的型和株间具有高度保守性,是细胞免疫的主要识别位点.本研究利用家蚕杆状病毒为载体,在家蚕培养细胞和幼虫中高效表达了具有生物活性的HCVCE2融合蛋白,为今后该蛋白免疫学特性及疫苗的研究、临床诊断试剂的开发提供了参考资料.
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利用单个B细胞分选方法获得HIV-1单克隆抗体基因及功能鉴定
目的 从人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)感染者中获得单克隆抗体基因及功能鉴定.方法 单细胞流式分选得到抗原特异性单个B细胞,基因扩增和测序得到抗体可变区序列,BioEdit软件包中Sequence Identity Matrix程序分析基因序列一致性,免疫遗传学数据库分析抗体基因家系和突变率,酶联免疫吸附试验测定抗体结合能力,TZM-bl/假病毒试验检测抗体中和能力.结果 从3个HIV-1感染者中分别获得了4个、7个和11个不同抗体的重链和轻链基因序列,其基因家系、CDR3长度和突变率广泛多样;验证了一个感染者的4个抗体基因序列,抗体A1和B3是HIV-1单克隆结合抗体,能同时与B亚型、CRF01 AE和CRF07 BC抗原蛋白结合;A1和B3也是HIV-1单克隆中和抗体,能够中和C亚型的MW965病毒,50％抑制浓度分别为0.04μg/ml和37.34μg/ml.结论 本研究成功获得了大量的单克隆抗体基因,并对其中的部分序列进行了功能验证,为单克隆抗体的分离和鉴定等研究工作提供了基础.
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从一名HIV-1感染者中分离出能中和2株Tier 2病毒的单克隆抗体
目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl/假病毒中和试验测定抗体的中和能力.结果 从一个HIV-1 B亚型病毒感染者中分离到了E11和H2两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体;E11和 H2抗体的重链基因均来源于 IGHV4-4*08家系,突变率分别为15.79%和14.74%,轻链基因均来源于IGKV3-15*01家系,突变率分别为8.33%和7.95%;两个抗体可与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC病毒蛋白结合;E11和H2抗体对398-F1病毒(Tier 2)的50%抑制浓度分别为18. 78 μg/ml 和22. 43 μg/ml,中和25710病毒(Tier 2)的浓度分别为43.35 μg/ml和39.45 μg/ml.结论 本研究成功分离到了两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体,能够为相关艾滋病疫苗的设计提供研究基础.
关键词： 单克隆抗体 中和活性 流式分选 二级难中和 人类免疫缺陷病毒1型 -
具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用
目的：制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性的阳性杂交瘤细胞系。取阳性杂交瘤细胞系腹腔注射BALB/c小鼠,采集腹水,通过亲和层析纯化获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,进行抗体亚型鉴别和单克隆抗体可变区序列测序。后,获得单克隆抗体后进行胶体金快速检测试纸条的建立。结果获得1株具有中和狂犬病病毒活性、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,标记为CTN-McAb1,收获小鼠腹水,并经纯化后获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,纯度可达95%以上,抗体为IgG1亚型。成功制备人用狂犬病疫苗有效抗原检测胶体金试纸条。结论成功制备了1株具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体并进行初步应用,这对人用狂犬病疫苗的质量控制具有较强的应用价值。
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从噬菌体库中筛选抗SARS病毒S蛋白的Fab中和活性抗体研究
目的从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性的抗S蛋白Fab片段抗体. 方法 ELISA方法对抗体库进行富集筛选及人源抗体克隆结合活性的测定,竞争ELISA初步筛选有中和活性的抗体,中和试验进一步确定中和活性,进而对其序列进行测定和分析. 结果特异性富集了抗S蛋白噬菌体抗体,竞争ELISA筛选出两株抗体可部分阻断中和抗体2C5与S蛋白的结合,中和试验确定其具有一定中和活性,编号为M1A和P8A,测序结果表明它们为两株不同的抗体克隆. 结论筛选获得了两株抗体可部分中和SARS病毒活性,它们的获得为探索SARS病毒感染的被动免疫治疗打下了一定基础.
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芋螺毒素GI抗血清制备及中和活性研究
目的 测定芋螺毒素GI与牛血清白蛋白(BSA)偶联物免疫小鼠后产生的抗血清是否具有中和GI毒素作用.方法 戊二醛法制备GI-BSA偶联物,免疫小鼠,制备GI小鼠抗血清,应用抗血清的抗体中和实验,验证其对GI的解毒作用.结果 SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,GI与BSA成功偶联,GI-BSA在>标志物相对分子质量(120×103)处有两条新蛋白带;GI-BSA(99 μg/只)每隔2周免疫1次,共免疫4次,第4次免疫后第10天抗血清中和滴度效价>1:64 000;混合100及200 μl 小鼠抗血清与≥1 LD50剂量GI,腹腔注射,100 μl 血清可使1×LD50毒素(16.3 μg/kg)组小鼠75%存活,200 μl血清可使25.8 μg/kg毒素组小鼠75%存活.结论 基于GI-BSA半抗原免疫的小鼠抗血清对GI毒素具有明显的解毒作用.
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抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测
目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段，并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡，4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达，占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高，效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实，IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素，在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。
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我国马免疫球蛋白制品现状及展望
马免疫球蛋白(equine immunoglobulin)是用目标抗原免疫马匹后,产生抗该种抗原的抗体免疫球蛋白,经胃酶消化、纯化提取制得,分别用于各相应疾病的预防(被动免疫)和治疗. 基本原理是采用无致病性的致病物质多次免疫马匹,待免疫抗体达到较高滴度后,采血提取抗体免疫球蛋白IgG, 利用胃蛋白酶切掉无中和活性的Fc段,仅保留具有中和活性的抗体V形F(ab')2片段,利用其特异性中和致病原的功能进行疾病预防与治疗.
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抗人VEGF人源化抗体及基因工程抗体真核高产量表达技术的研究
众多研究表明,肿瘤的生长及转移依赖于血管生成,血管内皮生长因子(VEGF)在血管形成中起关键作用.因此,研制具有中和活性的VEGF抗体,有可能成为抑制肿瘤生长及转移的新型药物,有良好的应用前景.
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具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备
目的 制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础.方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗.结果 获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株.制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性.结论 本研究获得了1株对MERS-CoV具有良好中和活性的单克隆抗体.
关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒 单克隆抗体 中和活性 受体结合区 -
抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测
目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础.方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27 b-A-hIL-1β-scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白.利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力.结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化.得到纯度为72.05％、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白.ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖.结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础.
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抗乙型肝炎病毒S抗原全人单克隆抗体的制备和表位探究
目的:针对乙型肝炎病毒S蛋白,制备全人单克隆抗体,对其亲和力、中和病毒活性及抗体所结合的抗原表位进行研究.所制备的全人抗体可应用于乙肝病毒的暴露后预防,为阻断母婴传播提供治疗手段.方法:通过流式分选和单细胞RT-PCR技术获得单克隆抗体;利用间接ELISA法检测抗体结合活性,进行表位分析;HepG2-NTCP细胞用于病毒感染,KHB乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒检测细胞上清中HBeAg的指标.结果:获得三株具有中和活性,可以结合三种乙肝病毒亚型S蛋白的抗体,其中1 F2、2 A1两株抗体的结合依赖于抗原蛋白的天然构象,2 H2抗体的结合依赖于连续的氨基酸序列;1F2、2H2抗体结合的位置位于S蛋白胞外区第一个免疫环状区域.结论:利用单细胞RT-PCR技术成功制备了针对乙肝病毒S蛋白的抗体,其具有中和作用.抗原表位位于S蛋白胞外区的第一个免疫环状区域内.
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BALB/C小鼠对不同佐剂SARS灭活疫苗的早期免疫反应
目的:研究含不同佐剂的SARS灭活疫苗免疫小鼠后,小鼠的早期细胞免疫和体液免疫反应.方法:灭活的SARS冠状病毒F69株分别与弗氏佐剂、氢氧化铝、CpG佐剂配伍,制备灭活疫苗.接种6周龄SPF级BALB/C小鼠.定时采血,分析小鼠外周血中CD4+、CD8+T细胞亚群动态变化,同时测定鼠血清中特异性IgG抗体及抗体的病毒中和活性.结果:由3种佐剂制备的SARS灭活疫苗免疫小鼠后,CD4+、CD8+T细胞百分比升高或无明显改变,CD4/CD8比值无显著性改变.其中,弗氏佐剂疫苗免疫小鼠的CD4+T细胞百分比升高较明显,且在一段时间内,维持在一个较高的水平;铝佐剂疫苗免疫小鼠后,未观察到明显T细胞亚群改变;而CpG佐剂疫苗免疫小鼠的CD8+T细胞百分比改变较其它佐剂疫苗改变更明显.与此相异的是,3种疫苗均可诱导小鼠产生较高滴度特异性IgG抗体,并且所产生的抗体具有中和活性.在初免后第34天,3种佐剂组的IgG抗体滴度分别为1∶12 800、1∶3 200和1∶1 600,中和效价分别为1∶2 560、1∶960和1∶320.结论:SARS灭活疫苗接种小鼠后,可诱导较强的体液免疫反应,同时轻度上调CD4+、CD8+T细胞活性,程度因佐剂而异.
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应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性
目的 建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性.方法 确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-GalN致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Prob it回归拟合对活性测定结果进行分析.结果 确定D-GalN的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100 μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P＞0.05).结论 联合应用D-GalN和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应.抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系.
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人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性和预防治疗作用
目的考察人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性及体内预防治疗作用.方法对分泌人源抗破伤风毒素单克隆抗体(人源单抗)的两株细胞进行培养,并对其抗体进行纯化及检定.结果人源单抗在小鼠体外具有中和活性.较高的剂量可完全中和毒素,延长小鼠生存时间.不同的人源单抗中和活性不同.单抗在小鼠攻毒实验中均具有一定的预防和治疗作用.结论人源单抗可用于破伤风感染的预防治疗.
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具有中和活性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定
目的制备具有中和活性抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体.方法采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并以ELISA结合免疫组化技术进行筛选.结果获得8株分泌抗呼吸道合胞病毒的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株分泌的单抗具有中和活性,效价1:160和1:320.结论成功制备出具有中和活性的呼吸道合胞病毒的单抗.
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pH值对重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体稳定性的影响
目的 研究pH值对重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体NM57稳定性的影响.方法 将NM57原液的pH值分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,分别置于4和40℃保存,于0、2、4、6周取样,观察其外观的变化,并检测其SDS-PAGE及SEC-HPLC纯度.中试规模制备NM57制剂(200 IU/ml,pH6.0),4℃放置3、6、9、12、18和24个月,取样观察其外观的变化,SEC-HPLC检测样品纯度,快速荧光灶抑制试验(RFFTT)检测样品中和活性.结果 在观察期内,所有样品的外观均保持澄清透明.不同pH值的NM57原液4℃放置6周,纯度无明显变化;40℃放置的不同pH值的NM57原液样品纯度变化有明显差异,NM57(5.0)和NM57(6.0)样品相对稳定.中试规模制备的6批NM57制剂4℃放置24个月,其纯度及中和活性均保持稳定.结论 NM57原液在甘氨酸-组氨酸缓冲系统中,pH 6.0条件下比较稳定,NM57(pH 6.0)制剂长期稳定性良好.
