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从一名HIV-1感染者中分离出能中和2株Tier 2病毒的单克隆抗体
目的 从中国HIV-1感染者中分离和鉴定能够中和二级难中和(Tier 2)病毒的单克隆中和抗体.方法 单个B细胞流式分选和单克隆抗体表达技术获得单克隆抗体,免疫遗传学数据库分析抗体可变区基因,酶联免疫吸附试验测定抗体的结合能力,TZM-bl/假病毒中和试验测定抗体的中和能力.结果 从一个HIV-1 B亚型病毒感染者中分离到了E11和H2两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体;E11和 H2抗体的重链基因均来源于 IGHV4-4*08家系,突变率分别为15.79%和14.74%,轻链基因均来源于IGKV3-15*01家系,突变率分别为8.33%和7.95%;两个抗体可与B亚型、CRF01_AE和CRF07_BC病毒蛋白结合;E11和H2抗体对398-F1病毒(Tier 2)的50%抑制浓度分别为18. 78 μg/ml 和22. 43 μg/ml,中和25710病毒(Tier 2)的浓度分别为43.35 μg/ml和39.45 μg/ml.结论 本研究成功分离到了两个能够中和2株Tier 2病毒的单克隆中和抗体,能够为相关艾滋病疫苗的设计提供研究基础.
关键词： 单克隆抗体 中和活性 流式分选 二级难中和 人类免疫缺陷病毒1型 -
可溶性MHC-肽四聚复合物法及其进展
抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)主要是CD8+ T细胞,少数为CD4+ T细胞,CTL对抗原的识别及自身的活化受MHC分子的限制.抗原特异性CTL在抗感染免疫、移植物免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用,定量分析抗原特异性CTL可为阐明免疫应答的自然发生过程提供重要信息,但是传统的检测分析方法均为间接的活性测定,费时费力.1996年Altman等[1]首创的可溶性MHC-肽四聚复合物法则能够直接定量检测抗原特异性CTL的比率,并通过流式分选用于其他方面的研究,操作简便,灵敏度、特异性很高,因而得到广泛应用.以下就其原理、应用及技术改进简述之.
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荧光探针及流式分选法追踪胰腺癌细胞增殖的研究
目的 应用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5,6-carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)荧光探针及流式分选的方法追踪胰腺癌细胞增殖情况.方法 应用低血清培养法(0.5％)对细胞进行细胞周期同步化;利用CFSE染色追踪胰腺癌全基因组突变文库细胞增殖;并于一定的时间点,应用流式分选法分选增殖速度减慢细胞群;通过CCK-8法检测分选前后的细胞增殖曲线.结果 CFSE探针可均匀染色胰腺癌细胞,呈现较强的绿色荧光;在CFSE荧光探针染色后的不同时间点(0、48、96及144h),胰腺癌细胞荧光强度呈现逐级衰减趋势;应用细胞饥饿法对细胞进行同步化后,细胞呈现更好的同步化衰减趋势;在一定的荧光衰减时间点(144h),通过流式分选从细胞突变文库中获得了胰腺癌增殖减慢细胞群;CCK-8实验显示,相对于分选前的细胞,分选出的荧光强度强的胰腺癌细胞群增殖速度明显减慢(P =0.006).结论 CFSE荧光探针可很好追踪胰腺癌细胞增殖,结合流式分选法可获得肿瘤突变文库中的增殖减慢细胞群.
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前列腺癌干细胞分离方法的对比及筛选
背景:前列腺癌干细胞是前列腺癌复发侵袭的重要原因,目前研究难点在于前列腺癌干细胞分离技术效率较低.目的:探索高效地从人前列腺癌PC-3及LNCap细胞株分离前列腺癌干细胞的方法.方法:采用含血清贴壁培养法及无血清悬浮培养法培养PC-3及LNCap细胞株,然后利用流式细胞表面标记CD133及CD44检测两种细胞在不同培养条件下可获取前列腺癌干细胞的比例,同时采用诱导分化实验初步鉴定前列腺癌干细胞特性.结果与结论:PC-3及LNCap细胞能在添加生长因子的无血清培养基中形成悬浮细胞球,接种在含血清培养基后可以诱导分化为贴壁细胞;无血清培养组的CD44+/CD133+细胞比例:PC-3为0.59%,LNCap为1.71%,含血清培养组中的CD44+/CD133+细胞比例:PC-3为0.32%,LNCap为0.73%,其中LNCap细胞采用两种方法所获的CD44+/CD133+细胞均高于PC-3所获的的细胞(P < 0.05),在两种细胞中无血清悬浮培养和含血清贴壁培养差异无显著性意义 (P > 0.05),但无血清悬浮培养周期长,获得细胞数相对较少,直接影响分选后肿瘤干细胞功能测定.因此可以证实含血清贴壁培养LNCap细胞较无血清悬浮培养法更能高效快捷的获取前列腺癌干细胞.
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宫颈癌HeLa细胞中Bcrp1~+、CK17~+及CD44v5~+表型细胞的检测与分离
目的:检测Bcrp1、CK17及CD44v5在宫颈癌HeLa细胞中的表达情况及相互关系,推测该3种抗体成为宫颈癌干细胞标记物的可能.方法:采用免疫荧光标记物流式细胞仪分选并检测HeLa细胞中的CK17~+、CD44v5~+、Bcrp1~+表型细胞;利用免疫细胞化学染色法,检测Bcrp1~+及Bcrp1~(-1)两组HeLa细胞中CK17及CD44v5的表达情况.结果:HeLa细胞中存在CD44v5~+细胞,所占比例为0.1%,CK17+细胞为0.7%,Bcrp1~+细胞为11%;Bcrp1~+组HeLa细胞中存在CK17~+及CD44v5~+细胞,而Bcrp1~-组中则无,组间比较差异有显著性(P<0.05).结论:表达CK17及CD44v5的HeLa细胞同时表达Bcrp1转运蛋白,CK17及CD44v5均有可能成为宫颈癌干细胞的标记物.
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ALDHhiCD44+细胞在乳腺癌组织中的表达及其与相关细胞信号传导通路之关系研究
目的:①探讨具有干细胞标记特性的ALDHhiCD44+细胞在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达情况;②探讨乳腺癌MDA-MB-231细胞系中是否存在乳腺癌ALDHhiCD44+细胞亚群,并分析Wnt/β-catenin与Notch细胞信号通路中的重要基殷β-catenin和Notch1,在ALDHhiCD44+细胞亚群中的表达情况.方法:①试验组为30例乳腺癌患者的术中新鲜癌组织,另取19例癌旁2 cm组织标本作为对照;②机械-酶方法消化组织、收集细胞悬液,并行肿瘤细胞原代培养,再经流式细胞仪检测ALDHhiCD44+细胞的含量;③流式细胞技术检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中ALDHhiCD44+细胞的表达含量,并分选出ALDHhiCD44+细胞,利用荧光定量RT-PCR技术检测ALDHhiCD44+细胞亚群和ALDHlowCD44+细胞亚群中β-catenin和Notch1的扩增情况.结果:①30例浸润性乳腺癌组织中有28例原代培养成功,19例癌旁组织中有15例能够培养出原代细胞.ALDHhiCD44+细胞在癌组织原代培养的细胞中的含量为(3.85±2.59)%(0.86~8.00%),在癌旁组织原代细胞中含量为(0.13±0.07)%(0.05~0.19%),两值相比差异有统计学意义(P=0.035,P<0.05);②乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,ALDHhiCD44+细胞含量为(0.82±0.067)%,且与ALDHlowCD44+细胞相比,ALDHhiCD44+细胞中β-catenin和Notch1的表达量是增高的(P<0.05).结论:通过肿瘤组织原代细胞培养、检测新途径,进一步证实ALDHhiCD44+乳腺癌干细胞的存在,且其在癌灶的表达量高于癌旁组织.结合细胞系MDA-MB-231中的ALDHhiCD44+细胞检测,其中的β-catenin和Notch1表达增高,表明ALDHhiCD44+细胞中Wnt/β-catenin和Notch细胞信号通路处于活化状态.
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乙醛脱氢酶-1作为心肌干细胞有效标志物的实验研究
目的 研究乙醛脱氢酶-1(ALDH-1)是否可以作为分选心肌干细胞(CSC)的有效标志物.方法 从裸鼠心脏分离培养细胞球,收集细胞球制成单细胞悬液,利用Aldefluor试剂结合流式细胞术来分选心脏球体细胞中的SSCloAldebr细胞(ALDH-1阳性细胞),通过增殖能力、克隆形成、表型分析及定向分化能力鉴定其干细胞(SC)的特性.结果 裸鼠心脏细胞无血清培养可形成细胞球,球体细胞中可检测到ALDH-1阳性细胞的存在；ALDH-1阳性细胞具有高增殖性、高克隆形成率及定向分化的能力,具有SC的特性.结论 裸鼠心脏中存在CSC;ALDH-1可以作为CSC有效的标志物.
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淋巴细胞-肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义
目的:探究淋巴细胞和肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征及意义.方法:以人肝癌细胞株PLC/PRF/5与人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)形成cell-in-cell胞内嵌合结构为研究模型,采用流式细胞术分析淋巴细胞钻入肿瘤细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的特征.利用流式分选技术分选出小鼠脾淋巴细胞与PLC/PRF/5细胞形成的cell-in-cell胞内嵌合结构,利用平板克隆形成实验检测cell-in-cell胞内嵌合结构对PLC/PRF/5细胞生物学行为的影响.结果:4h和8h时,以CD3/CD28抗体活化的PBMC对PLC/PRF/5细胞的伸入率分别为(15.75±1.28)％、(13.49±1.23)％,明显高于未活化PBMC的伸入率[(10.56±0.57)％,(1 1.38±0.97)％；P＜0.05]；且活化的PBMC在4h时的伸入率明显高于未活化PBMC在8h时的伸入率(P＜0.05).小鼠脾淋巴细胞伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构后,PLC/PRF/5细胞的克降形成率明显高于未形成cell-in-cell胞内嵌合结构的PLC/PRF/5细胞[(32.25±2.32)％ vs(21.92±2.02)％,P＜0.05].结论:活化后PBMC伸入PLC/PRF/5细胞形成cell-in-cell胞内嵌合结构的比率升高、时间提前,同时形成胞内嵌合结构的肿瘤细胞在体外克隆形成能力增强.
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流式分选仪FACSAriaⅡ分选GFP阳性乳腺癌MCF-7细胞株的条件优化研究
目的 研究流式分选仪FACSAriaⅡ分选绿色荧光蛋白(GFP)阳性乳腺癌MCF-7细胞株时不同条件选择对分选后细胞的纯度、得率和活性的影响.方法 流式分选仪FACSAriaⅡ分别选择70、85和100 μm三种喷嘴以及4-way purity、purity、yield三种分选模式分选MCF-7细胞的GFP阳性稳转株,计数分选后的细胞并计算分选得率,流式细胞术检测分选细胞的纯度,锥虫蓝染色法检测分选细胞的活性.结果 70、85和100 μm三种喷嘴分选GFP阳性细胞纯度均达99％以上,分选得率分别为(37.67±2.05)％、(56.33±2.62)％和(43.33±0.47)％,活细胞比例分别为(88.23±0.97)％、(91.87±1.05)％和(95.33±0.90)％；选择85 μm喷嘴,4-way purity、purity和yield三种分选模式分选细胞的得率分别为(51.00±2.45)％、(67.33±2.05)％和(74.00 ±0.82)％,纯度分别为99.6％、99.3％和96.2％.结论 流式分选仪FACSAriaⅡ分选乳腺癌MCF-7细胞GFP阳性稳转株,选择85 μm喷嘴以及purity分选模式较合适.
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利用流式分选技术富集小鼠单倍体精子细胞
目的:建立并完善流式分选单倍体精子细胞的方法. 方法:制备小鼠睾丸单细胞悬液;活细胞DNA染料Hoechst 33342孵育细胞;利用流式细胞术分选富集单倍体圆形精子细胞或长型精子细胞;在分选富集得到的精子细胞中,通过RT-PCR方法检测多种组蛋白乙酰化修饰酶基因的表达情况;检测组蛋白乙酰基转移酶抑制剂姜黄素对上述基因表达的影响. 结果:用Hoechst 33342染色结合流式分选方法可以高效地富集高纯度的精子细胞,还可以进一步纯化圆形精子细胞与长型精子细胞.RT-PCR结果表明,与睾丸整体组织相比,精子细胞中组蛋白乙酰化修饰酶基因的表达具有特异性,并受姜黄素处理的影响. 结论:该流式分选方法提高了富集单倍体精子细胞的效率和纯度,为阐明精子形成的机制提供了简便易学、适于推广的技术平台.
关键词： 流式分选 Hoechst 33342染色 单倍体精子细胞 小鼠 -
小鼠心源性CD51阳性细胞的分离与鉴定
[目的]探讨整合素蛋白αv(CD51)阳性细胞在小鼠正常心脏组织中的分布情况并鉴定其是否存在心肌干细胞相关特性.[方法]通过免疫荧光染色,RT-PCR,Q-PCR等方法,观察CD51+细胞在C57小鼠心脏中的表达及分布情况;应用流式细胞仪进一步检测心脏中CD51的表达比例,并分选出CD51阳性细胞进行体外培养;利用CCK-8实验检测细胞增殖能力;细胞稳定传代后进行成骨、成脂诱导,检测其多向分化能力.[结果]实验结果显示小鼠心脏中存在CD51十细胞,随年龄增大其表达水平呈下降趋势;在出生7d C57小鼠心脏组织中可观察到CD51+细胞广泛分布于心房、心室;流式细胞仪分选出生7 d C57小鼠心脏组织中阳性细胞结果显示阳性率约4％左右;诱导结果显示该细胞可以分化形成骨及脂肪组织,进一步证明其存在多向分化能力.[结论]小鼠心肌组织中CD51+细胞是具有干细胞性的细胞亚群,可能为心脏来源的MSC样干细胞.
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通过流式分选技术筛选HIV-1特异性单个B细胞
目的 探讨流式细胞分选技术在筛选HIV-I抗原特异性单个B细胞中的应用.方法 通过HIV-1特异性探针结合多色流式细胞技术,标记HIV-1抗原特异性B细胞;并结合单细胞流式分选,从两例HIV-1慢性感染者体内分离抗原特异性单个B细胞.结果 两个样本均有较强的中和活性,可以用作筛选中和抗体.两例感染者经流式分选后分别获得探针特异性目的细胞CD3-、CD8-、INDO-1 VIOLET-、CD14-、CD19+、CD20+、IgM-、IgG+、JRFLgp140+、JRFLgp140-D368R-各33和20个.结论 通过流式分选技术结合HIV-1特异性探针可以获得单个HIV-1抗原特异性B细胞,为后续获得有广谱中和HIV-1能力的抗体,设计抗HIV-1药物和HIV-1疫苗免疫原提供技术支持.
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TSG101和ABCG2基因在结肠癌SP细胞增殖及耐药发生和发展中的作用
目的 探讨TSG101基因和ABCG2基因在结肠癌SP细胞的表达及对耐药性的影响.方法 用流式细胞仪从结肠癌组织标本中分离结肠癌SP细胞,并用裸鼠鉴定,将结肠癌SP细胞置于体外含长春新碱抗癌药物的培养液中进行细胞培养,观察SP细胞对常规抗癌药物的多药耐药现象,应用RT-PCR检测结肠癌SP细胞TSG101基因和ABCG2基因的表达.结果 从结肠癌组织中成功分选出结肠癌SP细胞,种植裸鼠皮下长出移植瘤；用MTT法检测发现,0.5 μg/mL浓度长春新碱对SP细胞的生长抑制作用不明显,其存活率约为81％,而对非SP细胞的抑制作用明显,其存活率仅为37％,差异有统计学意义；RT-PCR检测SP和非SP细胞TSG101、ABCG2基因表达差异均有显著性(P＜0.05).结论 TSG101和ABCG2在结肠癌增殖和耐药的发生和发展中有重要作用.
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血管瘤血管内皮细胞体外分离纯化方法的优化
目的:寻找更高效的婴幼儿血管瘤内皮细胞培养方法,为婴幼儿血管瘤的研究提供基础的科研保证.方法:选取增生期婴幼儿血管瘤手术标本,采用组织块贴壁法与酶消化法结合进行原代培养;二代细胞进行流式分选,取CD31阳性的细胞继续培养.分别进行细胞形态学观察、细胞表面标记物免疫荧光鉴定、细胞表面标记物流式鉴定.结果:培养48~72h清晰可见组织块周围细胞游出,细胞核清晰,细胞呈长梭形及多边形,2周左右部分可形成"血管腔样"结构,20d可铺满平传代;细胞流式测定CD31阳性率达98.4%,VWF与CD31双阳率90.3%,免疫荧光染色CD31、VWF均呈阳性表达.结论:组织块与消化结合法经流式分选后可获得高纯度的内皮细胞,为下一步研究婴幼儿血管瘤增生消退机制奠定了基础.
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9L脑胶质瘤干细胞模型建立及MRI成像表现
目的:建立9L脑胶质瘤干细胞F344大鼠载瘤模型,采用3.0T磁共振成像评价肿瘤生长.方法:采用流式细胞仪分选CD133表达阳性细胞群,免疫荧光检测分选后细胞群的干细胞标记CD133、Nestin的表达情况.利用三维立体定向技术建立脑胶质瘤干细胞大鼠载瘤模型,定期行MR检查,观察颅内肿瘤生长情况.HE染色和免疫组织化学染色法观察肿瘤组织细胞形态和GFAP、S-100蛋白表达情况.结果:分选后细胞群CD133、Nestin蛋白表达阳性;干细胞荷瘤大鼠中位生存时间为(21.00±0.33)天;接种后1～3周MR扫描示肿瘤持续生长,增强扫描瘤体显像清晰,第3周末瘤周水肿显著;病理结果示肿瘤浸润生长,局部见出血、坏死,免疫组化示肿瘤组织胶质纤维GFAP阳性,S-100蛋白弱阳性.结论:流式技术分选9L脑胶质瘤干细胞建立的F344大鼠脑胶质瘤模型稳定可靠,符合恶性胶质瘤生物学特点;3.0T MR扫描仪能够动态观察脑胶质瘤生长状态.
