首页 > 文献资料
-
鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定.方法 用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法柃测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测.结果 筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1:40～1:160和(1～3)×10-4 7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为K,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5 mol/L.结论 已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础.
-
抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性.方法 以纯化的RV LLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株.采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性.结果 经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株.3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/k、IgG2a/k和IgG1/k型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1＞7F6＞5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34 000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性.结论 已成功制备了抗RV LLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别.
-
全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定
目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性.方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库.以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性.结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv.经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的seFv抗体.经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg.结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础.
关键词： 狂犬病病毒G蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体(ScFv) 中和活性 -
人源特异性抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体的制备及鉴定
目的:利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体.方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体.应用SDS-PAGE 、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性.结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg.结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用.
-
抗VEGF嵌合抗体的生物学特性分析
目的分析抗人血管内皮生长因子(VEGF)嵌合抗体VcD11的各种生物学特性,确定其人源性、特异性,中和VEGF的中和活性以及体内抑制肿瘤生长转移的抗肿瘤活性.方法采用纯化的VcD11进行ELISA和Westerm bbt实验,分析其人源性、特异性;采用抑制由VEGF刺激引起的内皮细胞增殖实验分析VcD11的中和活性;采用近交系小鼠T739的小鼠肺腺癌LA795实验动物肿瘤模型分析VcD11的抗肿瘤活性.结果VcD11在ELISA和Western blot实验中均呈阳性结果,并可抑制由VcD11的刺激引起的内皮细胞增殖,虽未能明显抑制小鼠肺腺癌LA795原发瘤的生长,但可显著抑制其肺转移灶的形成和生长.结论抗VEGF嵌合抗体VcD11具有人抗体的恒定区,可与人VEGF特异地结合,并具有良好的中和活性和抗肿瘤转移的活性.它可能在临床治疗肿瘤中有着重要、广泛的应用潜力.
-
新型抗凝药——安卓
磺达肝癸钠(商品名:安卓)是葛兰素史克公司研发的第一个Xa因子抑制剂的化合专利药物,开创了抗凝药物的新一代.安卓是一种人工合成的、活化因子X的选择性抑制剂.其抗血栓活性是抗凝血酶III(ATIII)介导的对因子Xa选择性抑制的结果.通过选择性结合于ATIII,磺达肝癸钠增强了(大约300倍)ATIII对因子Xa原来的中和活性.而对因子Xa的中和作用阻断了凝血级联反应,并抑制了凝血酶的形成和血栓的增大.
-
具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建
目的 构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1β scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测.方法 使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1β scFv.将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白.使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性.结果 成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000.ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力.Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用.结论 通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础.
关键词： IL-1β 单链抗体 包涵体复性 中和活性 Realtime-PCR -
大鼠TNFR-Fc重组腺相关病毒载体的构建、表达及中和活性鉴定
目的 构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区(TNFR)融合大鼠IgG Fc片段的重组2型腺相关病毒载体(pAAV2/TNFR-Fc),并对目的蛋白TNFR-Fc的表达和生物学活性进行初步鉴定,为后续的类风湿关节炎基冈治疗研究做准备.方法 构建大鼠TNFR-Fc融合基因重组腺相关病毒(AAV)载体,体外转染293T细胞,收集转染上清,以ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达,并应用L929细胞测定重组表达产物的TNF-α细胞毒中和活性.结果 成功构建重组表达载体pAAV2/TNFR-Fc,在转染细胞上清中检测到目的蛋白TNFR-Fc的表达,其可有效中和大鼠TNF-α的L929细胞毒活性.结论 成功构建了大鼠TNFR-Fc融合基因,并验证了其在2型AAV载体上的分泌性表达,为进一步病毒包装及动物实验奠定了基础.
-
一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备
目的 制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性.方法 用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定.结果 获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1:8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9mol/L;ELISA及Realtime-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用.结论 所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础.
-
7型腺病毒中和多肽的筛选及其活性研究
目的 筛选7型腺病毒的结合多肽,并研究其对7型腺病毒的结合和中和活性.方法 利用噬菌体肽库,筛选7型腺病毒的结合多肽,非竞争ELISA法测亲和常数测定与7型腺病毒的亲和常数,微量中和试验测定对7型腺病毒的中和活性.结果 筛选到了GTS09多肽,其与噬菌体的复合物(GTS09-phage)能特异的结合7型腺病毒,并且能够高效的中和7型腺病毒,GTS09与BSA的复合物也有中和作用,但GTS09本身却没有中和活性.结论 大分子蛋白可能会改变GTS09的空间构象,从而使其具有中和7型腺病毒的能力.
-
Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制.方法 提取HSV-2 DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性.结果 HSV-2 gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体.结论 gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础.
-
重复给予恒河猴rhKGF后其免疫原性及抗体中和性质的检测
目的 测定恒河猴经静脉重复给予重组人角质细胞生长因子(rhKGF)后血清中特异性抗体的水平及抗体中和性质.方法 采用间接ELISA法检测猴血清中的抗体水平,同时采用32D - KGFR细胞检测抗体的中和活性.结果 确定了抗原包被浓度为10 μg·mL-1,抗体从1.6×103开始稀释,二抗稀释倍数为1:5×103的间接ELISA法实验体系；14 ～ 56 d均可检测到抗体的存在；生物学活性测定的结果显示其为非中和性抗体.结论 重复给予恒河猴rhKGF的毒性试验中,部分猴的血清中检测到抗体,但不是中和抗体.
关键词： 重组人角质细胞生长因子 ELISA 中和活性 恒河猴 -
EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定
目的:筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb), 并对其特异性和抗原表位进行鉴定.方法:采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb, 并进行抗体的中和效价、交叉反应性以及表位进行分析.结果:筛选出1株抗EV71病毒的mAb, 纯度大于95%, 抗体滴度达到10-7, 对EV71病毒具有广谱中和特性, 与CA16无交叉反应, 为VP1特异性, 并识别EV71的构象型表位.结论:筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病毒的mAb, 为研制EV71病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具, 并为研制治疗性mAb提供了条件.
-
具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用
目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用.方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv 的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定.建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究.结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%.鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10~(-5).ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好.该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用.结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb.该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用.
-
用于构建抗人TNF嵌合抗体的鼠单克隆抗体中和活性的鉴定
目的: 筛选构建抗人TNF嵌合抗体所需高质量的鼠源性mAb. 方法: 从一组分泌抗人TNF mAb杂交瘤细胞中, 挑取3株D2、E6和F6, 按常规方法制备腹水.用饱和硫酸铵盐析后, 分别用蛋白A亲和层析和QFF阴离子交换层析法, 纯化D2株分泌的mAb(IgG2b)和E6和F6株分泌的mAb(均为IgG1).纯化前后, 3株mAb的效价, 采用间接ELISA法测定.纯化的3株mAb的中和活性, 通过它们对TNF诱导的L929细胞死亡和上调ECV304细胞上ICAM-1表达的抑制作用来进行鉴定.结果: 间接ELISA检测表明, 3株mAb D2、E6和F6纯化前的效价分别为1×10-6、1×10-7和1×10-7, 纯化后效价分别为0.01、0.002和0.002 mg/L.mAb中和活性的检测表明, 浓度为0.16、0.40和0.50 mg/L的D2、E6和F6, 可保护2×104 U/L TNF诱导的L929细胞半数不发生死亡.1.0 mg/L的mAb D2、E6和F6, 对2×105 U/L TNF使ECV304细胞上ICAM-1表达上调的抑制率, 分别为70.1%、60.1%和60.1%; 3株mAb的浓度降到0.1 mg/L时, 抑制率仍可达到60.1%、53.7%和59.0%.结论: 所选3株mAb的效价及中和活性均较高, 可作为抗人TNF嵌合抗体的候选mAb.
-
一种筛选中和活性抗人TNF单抗细胞模型的建立及其应用
目的:建立一种筛选中和活性抗人肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF) mAb细胞模型,并从一组抗人TNF mAb中筛选出具有相对较高中和活性的mAb. 方法:用含100 mL/L FCS的DMEM细胞培养液将L929细胞的浓度调整到1×108/L,按每孔100 μL,加入至96孔细胞培养板中,培养过夜. 弃细胞培养上清后,将200 μL的实验液转入培养板中,继续培养16 h. 活细胞用结晶紫染色,脱色后,于570 nm波长测定A值. 结果:浓度在0.3～0.5 mg/L范围内的放线菌素D(antinomycin D, ActD)对L929细胞的生长抑制作用比较稳定;TNF的浓度高于20 kU/L时, 能够使95%以上的实验细胞发生凋亡; 浓度在12.5～50.0 μg/L范围的mAb对TNF的中和作用具有明显的剂量依赖关系; 在ActD, TNF和mAb的浓度分别为0.35 mg/L, 20 kU/L和25.0 μg/L的条件下,发现D2的中和活性与阳性对照抗体无显著性差异(P>0.05),但高于阴性对照抗体,E6,D12,E11 (P<0.01). 与阴性对照抗体比较,E6, E11也具有一定的中和活性(P<0.05),而D12无中和活性(P>0.05). 结论:本研究建立的mAb抑制TNF诱导L929细胞凋亡的细胞模型可用于筛选中和活性抗TNF mAb;D2的中和活性相对较高,可作为构建治疗性嵌合抗体的制剂.
-
人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析
目的 在大肠杆菌中表达抗人TNF-α单链抗体(ScFv)，并分析 它的结合活性和中和活性. 方法 在获 得抗人TNF-α E6ScFv的基础上，用热诱导载体pBV220在大肠杆菌中表达E6ScFv蛋白. ELIS A测定抗体的结合活性，实时BIA技术确定亲和常数，L929 细胞毒试验分析其中和活性. 结果 克隆了抗人TNF-α E6ScFv基因的热 诱导载体pBV220在大 肠杆菌中，经42℃热诱导，得到了相对分子质量(Mr)约为27 000的重组蛋白质，表达 量占菌体 总蛋白的18%. 对在大肠杆菌中表达的E6ScFv进行了复性和亲和层析纯化，并进一步证实： ①E6ScFv具有与hTNF-α结合的活性，其结合表位与亲本抗E6单克隆抗体(mAb)相同；②E6S cFv与hTNF-α的亲和常数为3.71×104 M-1；③E6ScFv具有中和hTNF-α细胞毒作 用的活性. 结论 以上结果有助于ScFv拮抗TNF-α的治疗.
-
人源天然抗TNF-αScFv抗体的筛选及性质分析
目的 以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,human TNF-α)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的ScFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kineticdissociation,KD).方法 以TNF-α梯度稀释后包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的富集筛选,制备TNF-α单克隆噬菌体抗体颗粒,经ELISA试验筛选阳性克隆后测序并分析;将正确的阳性抗体序列亚克隆到pET-26b表达载体上,原核表达后用Ni Sepharose 6 Fast Flow介质进行纯化;用MTT比色法对筛选的ScFv进行中和活性验证,并测定其中和抗体的KD.结果 通过3轮筛选共得到18个正确的抗体氨基酸序列,对其原核表达及纯化后得到的6株可溶性表达的抗TNF-α ScFv进行中和活性验证,并对其中有中和活性的4株ScFv抗体测定KD.结论 从人源天然ScFv噬菌体抗体库中成功地筛选出4株抗人TNF-α的ScFv中和抗体,其中1株ScFv抗体的KD为4.80×10-8,细胞毒中和率达到48.9％,达到了药用级抗人TNF-α中和抗体的研发要求,为全分子抗体药物的构建及稳定细胞株的筛选奠定了一定的基础.
-
鼻内接种复制缺陷型流感病毒诱导异亚型中和性黏膜抗体
作者研究了经由鼻腔免疫单价复制缺陷型delNS－H1N1流感病毒疫苗（7．7 log10 TCID50／志愿者）的志愿者的血清和鼻洗液样品中的交叉中和抗体水平。根据血清 IgG ELISA，黏膜 IgA ELISA、MNA或HAI在12名志愿者中有8名其抗体水平呈显著增高，有4名应答者血清和黏膜洗液中deINSI特异性ELISA IgA抗体明显升高且有极高的同亚型中和活性。然而4份血清不具有中和异亚型H3 N2和H5 N1流感病毒的中和活性，而四分之三的鼻洗液却具有中和上述异亚型流感病毒的活性。缺失试验结果表明是IgA而非IgG是鼻洗液具有交叉中和活性的原因。作者的发现表明病毒中和性IgA的诱导可能代表着鼻内免疫流感疫苗产生交叉保护的免疫相关物，也表明使用delNSI是一种制备保护人类免受季节性和大流行流感威胁的疫苗的有希望的方案。
-
人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定
实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(C6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv.经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6.将ScFv-c6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6.以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体.具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值.
