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抗CD4人-鼠嵌合抗体的表达和抗增殖效应
目的制备抗CD4人-鼠嵌合抗体.方法从分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH和VL的DNA片段,对VH和VL进行DNA序列测定和分析,证实VH和VL具有小鼠Ig可变区完整的结构功能后,将VH亚克隆至重链表达载体pγ1-Expr,VL亚克隆至轻链表达载体pκ-Expr,转化XL2-Blue细菌,通过菌落或质粒PCR筛选阳性克隆.通过电转染将VH-pγ1、VL-pκ共转染至小鼠骨髓瘤细胞X63Ag8.653,通过G418筛选、ELISA和免疫荧光鉴定.结果得到分泌抗CD4人-鼠嵌合抗体的阳性转染瘤细胞克隆.所得到的嵌合抗体在体外对PHA和IL-2诱导的PBMC增殖具有抑制作用.结论人-鼠嵌合抗体得到成功表达,并有可能作为免疫抑制剂应用于抗移植排斥和自身免疫疾病的治疗.
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B7嵌合抗体对强直性脊柱炎中单个核细胞的作用
目的 研究B7嵌合抗体对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)中单个核细胞的作用.方法 AS单个核细胞培养体系中,分别加入终浓度为5μg/ml的ch4E5和ch1 D1抗体,补体依赖的细胞毒性试验(MLCT)观察单个核细胞死亡得分的组间差异,流式细胞术(FCM)分析其膜型分子表达变化,ELISA检测其分泌细胞因子的情况.结果 MLCT中嵌合抗体组低于AS组得分(P＜0.01),FCM检测嵌合抗体组较AS组CD4/CD8比值下降(P＜0.05),CD154表达下降(P＜0.01),CD4+CD25high调节性T淋巴细胞增多(P＜0.01),加入嵌合抗体的单个核细胞培养体系分泌IL-2和TNF-α减少(P＜0.05),IL-4和TGF-β升高(P＜0.02).结论 B7嵌合抗体通过作用B7/CD28及CD40/CD154信号通路,改变AS中单个核细胞一些表面分子的表达和细胞因子的分泌,终影响单个核细胞.
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抗人肝癌基因工程嵌合抗体的构建及在Sp2/0细胞的稳定表达
目的构建抗人肝癌嵌合抗体,并在Sp2/0细胞中进行稳定高效表达.方法分别将HAb18轻、重链可变区基因克隆入真核表达载体pDHL构建重组载体pDHL/chHAb18.酶切及测序鉴定后,转染Sp2/0细胞,经甲氨蝶蛉(MTX)筛选获得抗性克隆.采用有限稀释法单克隆化后持续MTX加压培养.通过ELISA筛选高效表达的单克隆细胞株.表达产物纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时采用ELISA和免疫荧光法检测其抗原结合特异性. 结果成功构建了重组嵌合IgG抗体chHAb18的真核表达载体pDHL/chHAb18.转化Sp2/0细胞后,初步筛选得到了高效表达chHAb18的细胞株.经MTX加压培养,1株细胞的chHAb18表达量达到10mg/L.SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:目的蛋白分子质量约为160×103,还原后为2条带,分子质量约为52×103和27×103.上述蛋白条带均与羊抗人IgG抗体特异结合. 结论成功构建了抗人肝癌基因工程嵌合抗体chHAb18,并在骨髓瘤细胞中获得高效表达.为其进一步的应用研究奠定了基础.
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抗HBV preS1嵌合抗体的真核表达及活性分析
目的 通过真核系统表达抗HBV preS1嵌合抗体4D11并分析其活性.方法 通过RT-PCR方法从分泌抗乙型肝炎病毒preS1的鼠源单克隆抗体4D11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(Vκ)序列,并分别克隆到含有人γ1重链和κ轻链恒定区序列的pcDNA3.1-AH和pcDNA3.1-Ak质粒中,共转染人胚肾细胞变种(293 FT)细胞.通过Western blot、竞争ELISA、阳性血清阻断及血清中preS1的检测实验来分析其活性.结果 轻重链基因在细胞内正确组装成嵌合抗体分子并分泌至细胞外,具有结合活性.嵌合抗体可以很好的与病毒preS1结合,对阳性血清的检测效果与鼠单抗一致.结论 成功的利用293 FT细胞表达了4D11嵌合抗体,抗体保留了原鼠单抗的特异性和活性,为探讨乙肝抗体的治疗提供了试验资料.
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抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的表达及体外对癌细胞浸润的抑制效应
目的制备抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体. 方法从分泌抗人组织蛋白酶B单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA,通过RT-PCR扩增单克隆抗体VH和VL的DNA片段,对其进行序列分析,证实具有小鼠可变区完整的结构,利用基因工程技术将它们分别和人Ig的Cγ1和Cκ恒定区基因连接组建人鼠嵌合轻链和重链Fab抗体,并克隆到pcDNA3真核细胞表达载体.将重组体转染到中国仓鼠卵巢细胞 (CHO),通过G418筛选、ELISA检测和Western blot鉴定,分离纯化抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体,用于体外抑制癌细胞浸润的试验. 结果得到分泌抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的中国仓鼠卵巢细胞克隆(C62A2),分泌的抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体在体外能抑制癌细胞浸润. 结论人-鼠嵌合抗体的成功表达,将有可能用于组织蛋白酶B过度表达的有关疾病的治疗.
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抗VEGF165的嵌合抗体在小鼠骨髓瘤细胞中的表达
目的 减少鼠源性单抗的免疫原性,获得抗人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165, VEGF165)的人/鼠嵌合抗体.方法 将抗VEGF165鼠单抗VmD11的轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH分别克隆到带有人IgG1轻链恒定区基因Cκ,重链恒定区基因Cγ1的真核表达载体pAcyc-neo-Cκ和psv2-gpt-Cγ1上,构建了真核表达载体pAcyc-neo-Cκ/hu和psv2-gpt-Cγ1/hu,并应用脂质体转染的方法将其共同导入小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中进行表达.结果 转染后通过筛选培养获得了7个抗性细胞克隆,经亚克隆化培养得到4个稳定表达的阳性细胞株,ELISA检测到抗VEGF165人/鼠嵌合抗体表达,RT-PCR也证实了该嵌合抗体在mRNA水平上的表达.培养上清液中的抗体表达量约为10μg/L,腹水中约为100μg/L,经竞争ELISA实验和Western blot实验证实其具有与亲本鼠源单抗相同的VEGF165结合特性.结论 成功的构建了能与VEGF165结合的人/鼠嵌合抗体.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 嵌合抗体 基因工程抗体 -
抗CD20治疗性单克隆抗体的研究进展
作为治疗B细胞淋巴瘤的靶向药物,抗CD20单克隆抗体在治疗性抗体中占有重要的一席之地.经历十几年的研究发展,该类药物结构不断改进,适应症也随之增多.如今,该类抗体不仅可以用于治疗淋巴细胞来源的肿瘤,也逐步应用于一些自身免疫性疾病的治疗,其新型适应症还在不断探索中；同时,该类抗体临床给药方案不断优化,药物反应性不断提高,疗效和毒副作用都得以进一步改善,但和其他化疗药物联合治疗的确切作用机制尚仍有待进一步的深入研究.本文就近年来具有代表性的抗CD20治疗性单克隆抗体的研究新进展做一概述.
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人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗-空间稳定脂质体的制备及其体外靶向
目的研究人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗(chTNT-3)-空间稳定脂质体的制备方法、免疫活性及体外靶向性.方法合成聚乙二醇末端带吡啶二硫丙酰基的磷脂衍生物(PDP-PEG-HSPE),制备含PDP-PEG-HSPE的空间稳定脂质体,经二巯基苏糖醇还原后共价连接马来酰亚胺衍生化抗体.荧光胺法和钼蓝法测定脂质体与抗体的连接效率及抗体密度,激光散射粒度仪测定其粒径分布,ELISA法检测脂质体表面的抗体免疫活性.体外实验考察该免疫脂质体与固定Raji细胞的结合活性.结果 chTNT-3-空间稳定脂质体的粒径分布为(115±33)nm.当初始Ab/PDP-PEG-HSPE=1:10时,脂质体与抗体的连接效率为71%,抗体密度为106μgAb/μmol PL.chTNT-3经化学修饰后连接到脂质体表面,其免疫活性基本保留.chTNT-3-空间稳定脂质体能特异性地结合固定Raji细胞.结论通过PDP-PEG-HSPE法共价连接抗体制备的chTNT-3-空间稳定脂质体能基本保留chTNT-3的免疫活性,具有体外靶向细胞核抗原的能力.
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应用抗体"框架重塑"技术构建人源化抗体fSM03
目的:应用抗体"框架重塑"(framework-reengineering)技术构建人源化抗体fSM03.方法:互补决定区(CDRs)克隆来源于嵌合抗体SM03;VL框架FR1,FR2,FR3和FR4分别优选自人源基因JOH,Vd'CL,WES和RZ;VH框架FR1,FR2,FR3和FR4优选自人源基因WAS,WAS,GAL和DOB,无须涉及任何鼠源残基的回复突变.分别合成轻链表达载体pEκ及重链表达载体pEγ,转染宿主细胞SP2/0.结果:fSM03保持了原有亲本抗体的功能特性,如CD22特异性和亲和力、细胞内化以及淋巴瘤细胞毒效应等.结论:应用框架重塑技术成功构建了人源化抗体fSM03,无须引入新的鼠源残基,较CDRs移植更为简便灵活.
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重组抗B细胞淋巴瘤嵌合抗体的构建及鉴定
目的:构建重组抗B细胞淋巴瘤嵌合抗体SM03,并进行特性鉴定.方法:分别克隆鼠抗人CD22单抗轻/重链可变区基因VL/VH,构建重组SM03嵌合抗体轻链表达载体(SM03pEkappa)和重链表达载体(SM03pEgamma).转染细胞经选择培养和克隆化,筛选出高效表达细胞株.采用SDS-PAGE、ELISA、流式细胞仪和免疫组化分析,检测纯化产物的相对分子质量、特异性和亲和力、淋巴瘤细胞毒效应,以及人体组织交叉反应性.结果:构建了重组人CD22嵌合抗体SM03表达系统,SM03嵌合抗体相对分子质量约1.5×105,还原为轻链和重链两条带,相对分子质量分别为2.7×104和5.0×104.SM03嵌合抗体特异于B细胞CD22抗原,对恶性淋巴瘤细胞具有生长抑制效应.结论:成功构建重组人CD22单克隆抗体,为恶性B细胞淋巴瘤的临床治疗和应用奠定了基础.
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抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定
目的:HER2/neu过度表达见于多种恶性肿瘤.作为肿瘤抗原,p185erbB2是一个理想的肿瘤治疗靶点.本实验在既往工作基础上,构建嵌合型抗p185erB2单克隆抗体(单抗)的真核表达载体,并在CHO-dhfr-细胞中表达,从而降低鼠源性抗体的免疫原性,为进一步的应用研究奠定基础.方法:RT-PCR扩增p185erbB2单抗1-2的轻、重链可变区基因,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中,脂质体转染CHO-dhfr-细胞.经RT-PCR、间接ELISA、Western blot检测人-鼠嵌合抗体的表达水平,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定.此外,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185erbB2的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用.结果:用RT-PCR、间接ELISA、Western blot方法证明人-鼠嵌合抗体在CHO-dhfr-细胞中表达;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185erbB2的细胞反应阳性,与低表达p185erbB2的细胞反应阴性;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185erbB2分子特异性结合;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185erbB2的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用.结论:CHO-dhfr-细胞表达的人-鼠嵌合抗体可与p185erbB2特异性结合,并可抑制高表达p185erbB2的肿瘤细胞生长,表明抗人p185erbB2人-鼠嵌合抗体具有肿瘤生物治疗的潜在应用价值.
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CD20嵌合抗体的构建、表达及纯化的实验研究
目的 构建CD20嵌合抗体,检测其活性并纯化该嵌合抗体.方法 从杂交瘤细胞株中分别扩增抗鼠CD20抗体的轻链和重链基因的可变区,并与人的轻链和重链恒定区连接,分别克隆到pTY5真核表达载体,然后共转染293E细胞,通过RT-PCR检测mRNA的转录,夹心ELISA检测抗体表达量,流式细胞术(FCM)分析嵌合抗体的结合特异性.结果 正确扩增得到抗CD20人鼠嵌合抗体的轻链和重链基因片段并成功构建重组真核表达载体pTY5-CD20H和pTY5-CD20L,在293E细胞中进行瞬时表达,RT-PCR显示抗体基因在细胞中进行了成功的转录,ELISA测定抗体表达量在15～24 ng/mL之间,流式检测结果证实细胞上清分泌的抗CD20嵌合抗体可与NS-1细胞株结合,并通过protein A柱亲和层析获取高纯度的抗CD20嵌合抗体.结论 成功构建表达抗CD20嵌合抗体的载体,且表达的抗体具有结合活性,为下一步研究慢性荨麻疹的发病机制及治疗打下基础.
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提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的表达和抗体的功能鉴定
目的探讨人-鼠嵌合抗体ch-BD1体内和体外的表达和功能. 方法用分子生物学方法得到系列弱化表达的双氢叶酸还原酶(DHFR)基因片段,将其克隆入载体pDHL-BD1中构建得系列弱化表达DHFR基因的人-鼠嵌合抗体pWSD1-BD1, pWSD2-BD1, 和pWSD3-BD1.将这些嵌合抗体以及pDHL-BD1分别转染缺陷表达DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)/DHFR-细胞,以Northern印迹鉴定其DHFR基因表达水平.将不同浓度的氨甲蝶呤(MTX)加入转染细胞的培养液,测定上清中的抗体水平.用99m标记纯化的ch-BD1,加入系列稀释的人膀胱癌EJ细胞溶液中,测定结合在细胞上的抗体放射活性,计算标记抗体的亲和常数.将人膀胱癌EJ细胞注射入3只Balb/C小鼠后肢根部,4周后对肿瘤进行放射免疫显像.将标记抗体注射入小鼠尾静脉,分别于2 h, 6 h, 22 h 和24 h后进行放射显像. 结果构建载体的DHFR基因表达活性由强至弱的顺序为pDHL-BD1>pWS1-BD1>pWS3-BD1>pWS2-BD1.MTX浓度为10-6 mol/L时ch-BD1的表达水平与DHFR基因的基础表达水平明显相关,DHFR基础水平越高抗体的表达水平亦越高.EJ细胞与标记抗体孵育后,ch-BD1的免疫活性分数为76%,亲和常数为3.56×109 M-1; 鼠单抗BD1的免疫活性分数为81%,亲和常数为1.22×109 M-1.99m标记的ch-BD1经尾静脉注射入小鼠体内后6 h主要分布于肿瘤部位,22 h后特异地分布于肿瘤部位,24 h后仍浓聚于此. 结论 DHFR基因基础表达水平的降低有效地增加MTX对外源基因的扩增作用.抗人膀胱癌人-鼠嵌合的表达具有理想的体内外对人膀胱癌的亲和活性,具有一定的临床应用前景.
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单克隆抗体人源化技术研究进展
随着分子生物学技术的发展，应用DNA重组技术、抗体库技术及转基因技术对鼠源性单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、互补决定区移植抗体和全人源抗体，它们从不同角度克服了鼠源性单抗临床应用的不足，为单克隆抗体在临床诊断及治疗中的应用带来了新的曙光，该文对单克隆抗体人源化技术的研究进展作一综述。
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美罗华联合CHOP治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的观察与护理
非霍奇金淋巴瘤是临床常见恶性肿瘤之一,低度恶性淋巴瘤大多属B细胞淋巴瘤,95%以上的B细胞非霍奇金淋巴瘤表达CD20抗原.非霍奇金淋巴瘤对放疗和化疗敏感,但复发率高,再次治疗缓解率低,缓解持续时间短.美罗华是人-鼠嵌合抗体-CD20单克隆抗体.我科应用美罗华联合CHOP方案治疗非霍奇金淋巴瘤患者12例取得了较好的疗效,现报道如下.
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CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究
目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.
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抗人黑色素瘤嵌合抗体真核表达载体的构建与表达
目的:构建嵌合型抗人黑色素瘤抗体的真核表达载体,并实现真核表达.方法:从3株杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因,插入含有抗人Tac抗原信号肽以及人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA中,转染293T细胞,进行嵌合抗体表达,并用RT-PCR、ELISA、Western blot免疫印迹等对抗体表达鉴定.结果:成功构建了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体,并实现其真核表达.RT-PCR证实了该抗体在mRNA水平上的表达,ELISA和Western blot证实了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体的表达.结论:成功表达了抗人黑色素瘤人-鼠嵌合抗体.
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抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究
目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定.方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因.用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测.结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒.瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力.结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础.
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抗人CD25嵌合抗体的稳定表达及鉴定
目的:构建抗人CD25嵌合抗体稳定细胞株,并对表达产物进行相关鉴定.方法:构建CD25嵌合抗体稳定表达质粒VEC-VTacH和3.3-VTacL并稳定转染CHO-DHFR-细胞,经选择性培养、有限稀释法克隆和MTX加压选择后扩大培养构建的工程细胞,Protein A纯化回收目的抗体后分别进行质谱分析、蛋白质N端测序和平衡解离常数(Kd)的测定.结果:CD25嵌合抗体稳定细胞株的抗体表达水平约为3.74~7.07 μg/ml,质谱分析结果表明其含有鼠源成分和人源成分,蛋白质N端测序表明其与亲本抗体N端序列完全一致,其Kd为2.35×10-10 mol/L,而亲本抗体的Kd为1.88×10-10 mol/L.结论:抗人CD25嵌合抗体保留了亲本抗体的抗原结合活性和亲和力.
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抗人CD86嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji生长抑制及杀伤作用研究
目的:研究CD86嵌合抗体ch1D1对天然高表达CD86分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji增殖抑制及杀伤效应.方法:经流式细胞术检测ch1D1对Raji细胞表面CD86分子的识别;经ch1D1(终浓度10 μg/ml)处理Raji细胞,MTT法检测对Raji细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测ch1D1诱导Raji细胞表面FasL及Fas的表达;MTT法检测ch1D1介导的外周血单个核细胞(PBMCs)对Raji为靶细胞的ADCC效应.结果:ch1D1可特异性识别Raji细胞表面CD86分子,阳性结合率为97.5%.ch1D1对Raji细胞增殖的抑制率为27.1%,较鼠源性亲本抗体1D1组(抑制率为38.8%)略下降,但两者统计学比较无差异(P＞0.05).与CD80嵌合抗体ch4E5联合应用抑制率可达56.3%,明显高于ch1D1单独作用的抑制率(P＜0.05).ch1D1作用4小时后,Raji细胞表达FasL水平开始升高,处理72小时阳性表达率为6.8%,较亲本抗体1D1组(阳性表达率3.2%)升高,但统计学比较无显著差异(P＞0.05);经ch1D1作用24小时,Raji细胞Fas表达水平开始上调,阳性率为6.1%,较1D1组(阳性表达率4.8%)升高,但无统计学差异(P＞0.05).与ch4E5联合应用均较ch1D1单独作用Fas及FasL的表达水平升高,但统计学比较仍无显著差异(P＞0.05).经ch1D1处理4、24、48、72小时,介导PBMC对Raji细胞杀伤率分别为25.0%、52.0%、71.3%、72.7%,与人IgG1及鼠源亲本抗体对照组相比均明显升高,具有显著差异(P＜0.05).结论:抗人CD86嵌合抗体可抑制高表达CD86分子的肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,与嵌合抗体Fc段介导的ADCC效应具有协同抗肿瘤作用.
