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人源化抗体用于病毒性疾病治疗的研究进展
抗体对于病毒感染的被动免疫治疗具有重要作用,目前人源化抗体研究技术的发展已使抗体的临床应用成为可能,针对很多强致病力病毒,已有很多治疗性人源单抗研究的报道,并显示出良好的应用前景.
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SARS冠状病毒抗体工程的研究、应用及进展
SARS冠状病毒(SARS-CoV)抗体工程的研究建立了SARS的快速检测方法,深入探索了病毒的传播途径及致病机理.人源化抗体的研制及动物试验的成功使单克隆抗体用于SARS-CoV的预防及治疗成为可能.
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人源化CDR3δ1移植性抗体对PBMC治疗肝癌的影响
目的 研究人源化CDR3δ移植性抗体GTM-Fc对PBMC治疗肝癌的影响.方法 裸鼠皮下注射HepG2.2.15肝癌细胞,建立移植瘤模型,将荷瘤裸鼠分成PBS组、PBMC和PBMC+ Ab 3组,每组9只,PBS组瘤内注射100 μL PBS/只,PBMC组注射1×106 PBMC/100μL/只,PBMC+ Ab组注射3μg GTM-Fc/1×106 PBMC/100 μL.每3天给药1次并测体质量和肿瘤大小,给药5次后的第3天处死裸鼠.流式细胞仪检测GTM-Fc与肝癌细胞系的结合能力,抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)检测GTM-Fc对PBMC杀伤肝癌细胞系的影响.结果 人源化CDRδ1移植性抗体GTM-Fc与肝癌细胞系有良好的结合能力.体外实验证明,它能够促进PBMC对肝癌细胞系的杀伤作用.结论 人源化CDR3δ移植性抗体GTM-Fc能够促进PBMC对肝癌的杀伤作用,为研究免疫治疗肝癌提供了新的线索.
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A型流感病毒通用型人源化抗体的构建及初步鉴定
目的 制备A型流感病毒通用型人源化抗体并进行鉴定. 方法 通过文献检索、蛋白质序列数据库(Swissprot)、蛋白质结构数据库(PBD)等获得抗流感抗体的序列信息,经计算机分析软件InsightⅡ分析抗体结构,采用分子模拟、分子对接等方法分析抗体的轻、重链可变区基因结构,用昆虫细胞偏嗜密码子优化氨基酸序列,合成抗流感病毒抗体轻、重链可变区基因;对合成氨基酸序列中的轻、重链可变区基因作酶切鉴定,将轻链可变区基因与杆状病毒表达载体PAC-κ-CH3连接,构建PAC-κ-L-CH3,酶切合成的重链可变区基因与PAC-κ-L-CH3连接,构建PAC-κ-L-H-CH3重组表达载体,鉴定正确后,同杆状病毒DNA共转染至昆虫细胞(sf9)中,于27℃用无血清培养基培养,收集上清,应用各亚型流感病毒株灭活后进行血凝抑制试验和ELISA试验,检测制备的抗体对流感病毒的通用性;通过荧光抗体试验检测抗体在细胞中的表达. 结果 重组杆状病毒表达载体转染sf细胞后,传代上清中检测到抗体;血凝抑制试效价为1∶2;ELISA结果显示有3株制备的抗体对3种流感病毒呈阳性反应,1株对实验用的流感病毒株没有反应;转染后传代细胞的荧光抗体鉴定结果显示有阳性抗体表达. 结论 成功采用计算机筛选合成抗流感病毒抗体基因,初步获得A型流感病毒通用型抗体.
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新型抗EGFR人源化抗体基因的构建和表达
目的:构建并表达进一步人源化且效果显著增强的抗EGFR抗体.方法:通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗EGFR抗体的轻链和重链可变区序列,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双表达载体.瞬时转染293T细胞,用rProtein A亲和层析柱从细胞培养上清中纯化抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定.采用Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力;细胞侵袭实验初步检测抗体的功能.结果:成功构建3种不同突变体表达载体C2、C3和C5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×10~3和50×10~3两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合.Biacore3000实验结果表明,C3抗体与抗原具有良好亲和活性(亲和力为6.13×10~(-10) mol/L);细胞侵袭实验结果表明,C2和C3抗体对肿瘤细胞生长迁移均具有一定的抑制作用.结论: 成功构建、表达了3种抗EGFR人源化抗体C2、C3和C5,其中C3具有良好的抗原结合能力和抑制肿瘤细胞生长迁移能力.
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双夹心酶联免疫法检测生物样品中的人源化抗体MIL50
目的：建立酶联免疫吸附分析方法（ ELISA ）检测待测样品中的人源化抗体MIL50。方法用原核表达的重组蓖麻毒素（ ricin） A链（ RTA）突变体（ RiVax）为包被抗原，与辣根过氧化物酶（ HRP）标记的羊抗人IgG建立的夹心ELISA，检测生物样品中的人源化抗体MIL50。结果以蓖麻毒素和RiVax包被抗原，ELISA检测MIL50的结果显示，RiVax可与MIL50特异性结合，结合能力不低于全毒素蛋白，可以用于MIL50的定量分析。 RiVax的包被浓度为3 mg/L，对于溶解于含有吐温20（Tween 20）磷酸缓冲液（PBST）中的MIL50的检测灵敏度可达0．030 mg/L；与PBST样品相比较，含有同样浓度MIL50的大鼠血清ELISA的阳性结果明显减弱，不同的大鼠组织匀浆对于MIL50的检测有不同程度的干扰。结论夹心ELISA能够有效地用于人源化蓖麻毒素抗体MIL50的检测分析。
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新型抗uPAR人源化抗体的表达和活性检测
目的 制备抗尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)人源化抗体并初步检测它们与抗原的亲和能力.方法 通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗uPAR抗体的轻链和重链可变区基因序列,通过重叠PCR方法,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双向表达载体.瞬时转染293T细胞,收取细胞上清,rProtein A亲和层析法纯化目的 抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定,采用Biacore3000技术检测抗体与抗原的结合能力.结果 成功构建5种表达载体S1～S5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和55×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合.Biacore3000实验结果表明,S2、S4和S5抗体与抗原具有良好的亲和活性,且素和活性分别为1.74×10-8,1.49×10-8和1.05×10-8 mol/L.结论 成功构建并表达了5种抗uPAR人源化抗体,其中S2、S4和S5具有良好的抗原结合能力.
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抗CD20治疗性单克隆抗体的研究进展
作为治疗B细胞淋巴瘤的靶向药物,抗CD20单克隆抗体在治疗性抗体中占有重要的一席之地.经历十几年的研究发展,该类药物结构不断改进,适应症也随之增多.如今,该类抗体不仅可以用于治疗淋巴细胞来源的肿瘤,也逐步应用于一些自身免疫性疾病的治疗,其新型适应症还在不断探索中；同时,该类抗体临床给药方案不断优化,药物反应性不断提高,疗效和毒副作用都得以进一步改善,但和其他化疗药物联合治疗的确切作用机制尚仍有待进一步的深入研究.本文就近年来具有代表性的抗CD20治疗性单克隆抗体的研究新进展做一概述.
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应用抗体"框架重塑"技术构建人源化抗体fSM03
目的:应用抗体"框架重塑"(framework-reengineering)技术构建人源化抗体fSM03.方法:互补决定区(CDRs)克隆来源于嵌合抗体SM03;VL框架FR1,FR2,FR3和FR4分别优选自人源基因JOH,Vd'CL,WES和RZ;VH框架FR1,FR2,FR3和FR4优选自人源基因WAS,WAS,GAL和DOB,无须涉及任何鼠源残基的回复突变.分别合成轻链表达载体pEκ及重链表达载体pEγ,转染宿主细胞SP2/0.结果:fSM03保持了原有亲本抗体的功能特性,如CD22特异性和亲和力、细胞内化以及淋巴瘤细胞毒效应等.结论:应用框架重塑技术成功构建了人源化抗体fSM03,无须引入新的鼠源残基,较CDRs移植更为简便灵活.
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治疗性人源化单克隆抗体研究进展
目前正在研究中的生物技术药物有1/4以上是单克隆抗体药物,临床治疗中人抗鼠抗体反应(HAMA)的出现使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制.因此,对于疗程长、需反复给药的单克隆抗体药物,人源化是其重要而必然的发展方向.现阶段,已有30余个通过细胞工程和基因工程制备的人源化抗体应用于临床,适应证包括变态反应性疾病、恶性肿瘤、器官移植排斥反应、心血管疾病、病毒感染等难治性疾病.此外尚有近百个人源化抗体药物正处在临床前或临床研究阶段.预计它们将在人类疾病的治疗中发挥重要作用.
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治疗性单克隆抗体的研究进展及其免疫偶联物的抗肿瘤应用
目前正在研究的生物技术药物有1/4是单克隆抗体类药物,治疗性抗体已成为生物制药业发展快的领域之一,它们用于治疗如肿瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等.在发展初期,鼠源单克隆抗体为人类疾病的研究起到了重大的推动作用,但其存在着严重的不足,单克隆抗体人源化已逐渐成为当前研究的热点.另外,将放射性物质、化疗药物以及生物毒素等与单克隆抗体偶联得到免疫偶联物,这些偶联物被单克隆抗体特异性地导向表达相应抗原细胞的表面,并发挥抗肿瘤效应,同时也降低了药物对正常组织的损伤.文中就有关单克隆抗体人源化的研究进展和抗肿瘤应用进行综述.
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人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体质控方法的建立
目的 建立人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体的质控方法.方法 采用还原/非还原型毛细管凝胶电泳(CE-SDS)测定人源化抗VEGF单抗的纯度;在0.5和25.0 mg·mL-1浓度条件下,采用分子排阻高效液相色谱(SE-HPLC)测定制品中单体和聚合物含量;毛细管等电聚焦电泳(cIEF)测定其等电点;阳离子交换高效色谱(CEX-HPLC)测定电荷异构体含量;反相高效色谱(RP-HPLC)和LC-MS检测Lys-C酶切后制品肽图;人血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells,HuVEC)增殖抑制试验测定其生物学活性;其余项目按照2015年版《中国药典》要求进行.结果 人源化抗VEGF单抗原液和成品的还原型CE-SDS的纯度分别(97.77±0.25)％和(97.43±0.57)％,非还原型CE-SDS纯度分别为(98.97±0.15)％和(98.73±0.06)％;0.5 mg·mL-1浓度下,原液和成品的单体含量分别为(98.07±0.55)％和(98.20±0.52)％;25.0 mg·mL-1浓度下,原液和成品的聚合物含量分别为(2.00±0.53)％和(1.93±0.55)％;CEX-HPLC检测原液和成品的酸性区含量分别为(18.33±0.64)％和(18.60±0.44)％,主峰含量分别为(69.03±0.80)％和(69.20±0.44)％,碱性区含量分别为(12.70±1.37)％和(12.20±0.87)％;cIEF和LC-MS测定原液和成品的等电点和肽图均与参比品一致;HUVEC增殖抑制法测定原液和成品的生物学活性分别为参比品的(107±6)％和(100±10)％.其他各项指标均符合《中国药典》要求及其他相关要求.结论 初步建立了人源化抗VEGF单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制.
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抗体药物研究进展及临床应用
抗体作为药物用于治疗疾病已有很长历史,随着抗体立体结构的阐明和分子生物学技术的发展,抗体从初的鼠单抗发展到鼠单抗入源化改造、基因工程抗体,入源化抗体.同时人们利用分子生物学技术改良抗体性能,使之有效到达靶部位,提高抗体效应功能.因此,抗体药物具有广阔应用前景,将在人类疾病治疗中发挥重要作用.
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抗人VEGF人源化抗体及基因工程抗体真核高产量表达技术的研究
众多研究表明,肿瘤的生长及转移依赖于血管生成,血管内皮生长因子(VEGF)在血管形成中起关键作用.因此,研制具有中和活性的VEGF抗体,有可能成为抑制肿瘤生长及转移的新型药物,有良好的应用前景.
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治疗性单克隆抗体研究新进展
治疗性单克隆抗体的快速发展在人类以肿瘤为主的多种疾病的治疗方面发挥至关重要的作用.为了降低鼠源抗体引起的超敏反应,治疗性单克隆抗体已由改型抗体,人源化抗体发展到全人抗体.随着生物技术的不断发展,相信人源化单克隆抗体的前景会越来越广泛.
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一种新的高亲和力的人源化抗CD19CAR-T细胞的构建及体外功能验证
目的 构建人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞(CAR-T),通过体外实验验证其杀伤白血病细胞的能力.方法 将人CD19的鼠源抗体(FMC63)进行了人源化改造,获得高亲和力的人源化CD19抗体;构建携带人源化CD19 CAR慢病毒载体,感染T细胞获得人源化CD19 CAR-T细胞(hCART19);按不同效靶比将效应细胞[hCART19、未转染的T细胞(阴性组)及对照病毒转染的T细胞(对照组)]及靶细胞(CHO-K1-CD19及Raji细胞)混合培养,LDH释放实验及ELISA法检测hCART 19杀伤白血病细胞的能力及细胞因子释放水平;白血病小鼠模型检测hCART 19的杀瘤效果.结果 LDH释放实验证实随着效靶比的不断增加,对靶细胞的杀伤率逐渐增加,当效靶比为10∶1时hCART19组的杀伤率大,在Raji细胞中为(87.56±1.99)％,明显高于阴性组[(19.31±1.16)％]及对照组[(21.35±1.19)％](P值均＜0.001).ELISA法检测显示Raji细胞作为靶细胞时,hCART 19组IL-2水平[(10.56±0.88)pg/ml]及IFN-γ[(199.02±12.66)pg/ml]较阴性组[IL-2:(3.55±0.26)pg/ml;IFN-γ:(37.63±0.85)pg/ml]及对照组[IL-2:(2.92±0.32)pg/ml;IFN-γ:(52.07±3.33)pg/ml]明显升高(P值均＜0.001).以上实验在CHO-K 1-CD 19细胞作为靶细胞时也出现了相似的结果.给予白血病小鼠模型尾静脉分别注射hCART 19、对照病毒转染的T细胞及未转染的T细胞,结果显示hCART 19组小鼠存活时间＞40 d,另外两组小鼠在20～ 30 d全部死亡,差异有统计学意义(x2=11.73,P=0.008).结论 成功构建了具有抗白血病活性的人源化CD19 CAR-T细胞,为下一步的临床研究奠定了基础.
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单克隆抗体人源化技术研究进展
随着分子生物学技术的发展，应用DNA重组技术、抗体库技术及转基因技术对鼠源性单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、互补决定区移植抗体和全人源抗体，它们从不同角度克服了鼠源性单抗临床应用的不足，为单克隆抗体在临床诊断及治疗中的应用带来了新的曙光，该文对单克隆抗体人源化技术的研究进展作一综述。
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抗体药物研究状况分析
目前，抗体药物临床应用时间已经超过三十年，现阶段很多用于治疗目的的抗体药物广泛应用在临床实践工作中，其在临床药代动力学相关分析和研究中也取得一定成效。随着DNA重组技术的不断发展与进步，加之人源化抗体的出现，一定程度上解决了临床使用难题。抗体药物研究不仅在方法上存在较大困难，在实践中也会受到多种因素的制约。针对具备显著靶向的抗体药物，对其靶向的主要分布情况进行研究，是药动学研究及分析的关键。
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单克隆抗体研究进展
随着人们对抗体结构与功能的认识不断深入,抗体不仅在抵抗外来生物物质方面有着重要作用,而且利用它本身来防治疾病更是研究热点.单克隆抗体技术的问世,使得研究和生产单抗药物成为现实.本文就单抗药物的历史、现状、存在的问题及展望做一简要综述.
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单克隆抗体人源化的进展及应用
鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所代替,本文介绍了几种人源化抗体构建的策略和表达系统以及人源化抗体在临床方面的应用.
